藥物篩選基因通常只需要低至中等程度的表達(dá)即可有效，但也有例外。以下是細(xì)胞無抗藥性的最常見原因：

使用的抗生素劑量過高

藥物反應(yīng)因細(xì)胞不同而異。在使用抗生素之前，建議您對細(xì)胞制作一個(gè)致死曲線（也稱“劑量反應(yīng)曲線”），摸索出能有效殺死未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的最低藥物濃度。即使細(xì)胞有抗藥性基因，但過高的藥物劑量也會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，且還可能危害細(xì)胞的生長狀態(tài)。某些細(xì)胞對某些藥物極其敏感，這時(shí)您可能需要考慮更換另一種藥物篩選標(biāo)記。

了解常用抗生素工作濃度和藥篩時(shí)間

弱啟動子驅(qū)動藥物篩選基因的表達(dá)

有一些啟動子本身就比較弱（如UBC），只能驅(qū)動藥物篩選基因的弱表達(dá)，您可以考慮使用一個(gè)強(qiáng)的廣泛性啟動子（如EF1A）。

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在慢病毒和MMLV載體中表達(dá)藥物篩選基因

對于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)（慢病毒或者M(jìn)MLV），聚腺苷酸化信號（poly A）不能存在于LTR之間，因?yàn)檫@會抑制病毒的包裝。多聚腺苷酸化信號存在于3'LTR中，來自上游啟動子的轉(zhuǎn)錄會經(jīng)過上游ORF的末尾繼續(xù)往下游的啟動子和ORF轉(zhuǎn)錄，這會導(dǎo)致下游ORF的表達(dá)部分受到抑制。當(dāng)下游ORF為藥物篩選基因時(shí)，其表達(dá)會大大減少。您可以采取如下措施提高熒光蛋白的表達(dá)：

• 使用不同的載體系統(tǒng)，比如使用常規(guī)載體，腺病毒載體或腺相關(guān)病毒載體

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• 如果考慮在多順反子的上游表達(dá)盒表達(dá)藥物篩選基因，您可以使用2A linker連接目的基因和藥物篩選基因。然而，這可能會影響多順反子中其他ORF的生物學(xué)功能，也可能導(dǎo)致藥物篩選基因表達(dá)較弱，且會增加載體構(gòu)建的成本和時(shí)間。

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藥物篩選基因在IRES的下游

在包含一個(gè)或多個(gè)IRES元件的多順反子中，與上游ORF相比，下游ORF表達(dá)水平比較低（通常為上游的10%-20%）。如果藥物篩選基因在IRES的下游表達(dá)，則表達(dá)量會較低。如果您必須在多順反子的下游表達(dá)藥物篩選基因，您可以考慮使用2A肽（如P2A或T2A），而不是IRES。通過使用2A肽，多順反子下游ORF通常與上游ORF的表達(dá)量相當(dāng)（或稍微低一點(diǎn)）。然而，2A肽也有缺陷，如可能會影響靶基因（GOI）的功能。當(dāng)存在多個(gè)2A肽時(shí)，下游ORF傾向于以較低水平表達(dá)。另外，2A肽的自我切割并不是100％有效的，其效率會受上下游ORF序列的影響。需要特別注意的是2A肽的切割會在上游蛋白的C末端留下額外的短肽，并在下游蛋白的N末端留下額外的脯氨酸。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中，這種情況不會產(chǎn)生不良影響，但是在某些情況下可能會影響蛋白功能。

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