服務(wù)詳情

服務(wù)類型

我們提供的VACV載體構(gòu)建和病毒包裝服務(wù)如下：

• 使用VACV BACYAC骨架克隆的VACV載體，包括WR毒株和MVA毒株
• VACV病毒包裝

VACV載體克隆

云舟生物自主研發(fā)的“BACYAC”骨架專門為VACV載體克隆而設(shè)計。該骨架整合了細菌人工染色體（BAC）和酵母人工染色體（YAC）的關(guān)鍵元件。BAC相關(guān)元件允許該載體可以在大腸桿菌中以BAC形式擴增，而YAC相關(guān)元件允許該載體在釀酒酵母中復(fù)制BACYAC載體因此可靈活地在大腸桿菌系統(tǒng)和酵母系統(tǒng)中進行載體擴增和序列修飾。

EGFP/LacZ報告基因、BACYAC骨架序列、以及痘苗病毒啟動子被克隆到J2R位點之間的TK（胸苷激酶）基因中，以獲得減毒重組載體。我們的減毒W(wǎng)R毒株和MAV毒株可以被應(yīng)用于基礎(chǔ)科研、臨床前試驗、臨床研究等領(lǐng)域。通過進一步直接突變改造，我們還可以提供減毒程度更高的痘苗病毒。

VACV BACYAC載體的基本設(shè)計如圖1所示。

圖1 含有EGFP或LacZ報告基因的VACV BACYAC骨架

TK：胸苷激酶基因，在重組VACV中失活以產(chǎn)生減毒病毒。

p7.5：痘苗病毒啟動子。VACV在細胞質(zhì)中復(fù)制需要痘苗病毒啟動子。 p7.5 通常用于驅(qū)動轉(zhuǎn)基因表達，因為它在病毒復(fù)制的早期和晚期具有轉(zhuǎn)錄活性。

LoxP：Cre重組酶作用的重組位點。兩個LoxP之間的序列可以被Cre重組酶剪切下來。

ITR：痘苗病毒基因組兩端的反向重復(fù)序列，帶有VGF基因。

N2：N2基因在病毒早期感染時表達，抑制宿主免疫過程。

M1：M1基因可防止宿主細胞凋亡，增強病毒生產(chǎn)。

報告基因：由啟動子驅(qū)動表達的EGFP和LacZ報告基因，用于識別轉(zhuǎn)染成功的細胞。

BACYAC骨架：整合了細菌人工染色體（BAC）和酵母人工染色體（YAC）的載體骨架，可以在大腸桿菌種攜帶氯霉素抗性基因選擇性擴增，也可以在釀酒酵母中使用His3自噬選擇標(biāo)記進行擴增。

運輸與存儲

我們的VACV病毒保存于HBSS緩沖液，并以干冰形式運輸。接收到病毒后，VACV可以在-80°C長期存儲（可至少穩(wěn)定存儲6個月），或者在-20°C存儲一周。VACV的保質(zhì)期約為1年。請避免反復(fù)凍融VACV以避免顯著的滴度下降。

VACV制備與質(zhì)量控制

VACV包裝流程如圖2所示。攜帶目的基因的非感染性VACA BACYAC載體轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞，同時轉(zhuǎn)導(dǎo)非復(fù)制型的雞痘病毒作為輔助病毒。由于VACV具有廣泛的組織嗜性，因此可用多種類型的細胞包裝生產(chǎn)VACV。云舟生物首先采用多種類型的細胞用于VACV的復(fù)蘇和擴增。我們使用嗜斑純化法初步獲得病毒克隆，然后進行病毒擴增。細胞外包膜病毒 (EEV) 和細胞內(nèi)成熟病毒 (IMV) 可以分別從上清液和細胞裂解液中收獲。EEV通過PEG濃縮后，與IMV的病毒液合并。對于超純化VACV，病毒顆粒經(jīng)過進一步的蔗糖密度梯度離心以獲得純化和濃縮。

圖2 典型的VACV包裝流程。

對于每一個生產(chǎn)的重組VACV病毒，質(zhì)量控制包括滴度檢測、無菌測試、支原體檢測等。如果VACV病毒載體表達熒光蛋白，則我們會進行熒光轉(zhuǎn)導(dǎo)測試。如果VACV病毒載體含有藥篩標(biāo)記，我們也會在轉(zhuǎn)導(dǎo)測試后伴隨進行藥篩測試。此外，對于超純化VACV，我們會進行內(nèi)毒素檢測。

試驗驗證

我們的VACV載體經(jīng)詳盡驗證可以穩(wěn)定用于生產(chǎn)活病毒。 圖3顯示了經(jīng)我們性能驗證的VACV病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK21細胞的效果。

圖3 表達EGFP的VACV轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK21細胞，MOI=0.5。轉(zhuǎn)導(dǎo)后0小時和72小時使用熒光顯微鏡成像。放大倍數(shù)：100×。左：明場。右：EGFP。

VACV背景知識

VACV是一種雙鏈線性DNA病毒，屬于痘病毒家族。它的基因組長度約為190 kb，可以插入大型轉(zhuǎn)基因（25-30 kb）。VACV的基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄完全發(fā)生在宿主細胞的細胞質(zhì)中，病毒基因組編碼DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄所需的所有蛋白質(zhì)。因此，VACV的病毒生命周期對宿主細胞機制的依賴非常小。

在病毒生命周期的早期階段，會產(chǎn)生許多免疫調(diào)節(jié)蛋白，幫助病毒從宿主的病毒防御機制中逃脫。成熟的VACV主要有兩種形式：在細胞裂解時釋放的細胞內(nèi)成熟病毒 (IMV) 和通過胞吐作用釋放的細胞外包膜病毒 (EEV)。這兩種形式都能夠通過病毒脂質(zhì)膜與宿主細胞膜的融合來感染宿主細胞，而無需與宿主細胞表面受體結(jié)合以進行感染。

VACV載體的主要應(yīng)用

重組VACV載體對于基因治療是一個富有前景的應(yīng)用工具，它具有許多優(yōu)點，比如良好的安全性、能夠容納很大的轉(zhuǎn)基因、可以感染多種類型的宿主細胞、可以在增強宿主免疫反應(yīng)的同時避免被宿主免疫系統(tǒng)靶向清除。

在痘病毒家族中，已經(jīng)開發(fā)出具有不同感染性能和復(fù)制能力的多種毒株，這會影響它們在臨床應(yīng)用中的實際使用。兩種非常常見的毒株是WR毒株和MVA毒株。雖然MVA由于其減毒特性而更常用于臨床場景，但WR的優(yōu)勢在于具有更高的復(fù)制效率并且可以更大程度地調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)。這兩種毒株目前均被廣泛用于科研和臨床研究。以下是應(yīng)用了VACV的一些主要研究方向：

腫瘤治療

除了直接裂解腫瘤細胞，VACV還可以通過招募免疫細胞使其分泌細胞因子來改變腫瘤微環(huán)境，從而引發(fā)非直接的抗腫瘤免疫反應(yīng)。為了保持VACV這種天然的優(yōu)點并增強其安全性，重組VACV進行了特定的基因修飾。以Pexa-Vac溶瘤VACV為例，其減毒特性是通過刪除病毒TK基因?qū)崿F(xiàn)的，并且該病毒還表達GM-CSF轉(zhuǎn)基因以增強宿主免疫反應(yīng)。該病毒已經(jīng)用于治療多種實體瘤的臨床探索。當(dāng)前還存在其它幾種溶瘤VACV的臨床試驗，可見VACV作為一種溶瘤治療工具正在快速發(fā)展。

疫苗制備

VACV作為外源抗原遞送系統(tǒng)也相當(dāng)有效。VACV可以包裝極大的DNA、作為天花疫苗具有很長的應(yīng)用歷史，這些特性使其有利于成為對抗多種疾病的有力疫苗載體，比如針對HIV和狂犬病。

VACV載體的應(yīng)用優(yōu)勢

廣泛的組織嗜性：VACV不具有用于感染特定細胞的表面蛋白，而是通過膜融合的方式感染細胞，使其可以侵入各種類型的包括分裂與非分裂細胞。

不整合宿主基因組：VACV的短生命周期只有8小時，且病毒復(fù)制全程在細胞質(zhì)中進行，不具有病毒基因插入宿主基因組的風(fēng)險。

腫瘤細胞中高復(fù)制效率：VACV在腫瘤細胞中可以選擇性地高效率復(fù)制，導(dǎo)致腫瘤細胞裂解。

病毒復(fù)制機制獨立：VACV的mRNA轉(zhuǎn)錄極少依賴宿主細胞的組分，使其可以適應(yīng)不同類型的宿主細胞。

宿主免疫逃避：VACV具備逃避免疫系統(tǒng)攻擊的能力，方式包括產(chǎn)生補體控制蛋白結(jié)合并抑制宿主白細胞，以及利用宿主細胞的細胞膜組分作為病毒的外包膜。因此VACV可以用于不同方式的注射方法從遠端遞送至靶組織或腫瘤位點。

極大的裝載量：VACV具有很大的基因組，可以容納的30 kb的外源基因。

高滴度且高感染性：VACV可以包裝產(chǎn)生很高的滴度，同時具有良好的感染性，只需要很低的MOI即可成功轉(zhuǎn)導(dǎo)。

視頻

暫無

文檔

使用說明書

VACV for In Vitro Applications

常見問題解答