當(dāng)您希望使用單個啟動子驅(qū)動多個ORF的表達(dá)時，您可以選擇將多個ORF置于啟動子后面，通過連接子（linkers）如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點（IRES）或2A肽將每個ORF分隔開，單個mRNA轉(zhuǎn)錄物將會產(chǎn)生多個蛋白。

作用機制

最常用的IRES元件來源于腦心肌炎病毒（EMCV），作為額外的核糖體募集位點起作用，允許翻譯起始發(fā)生在除了翻譯起始位點之外的mRNA內(nèi)部區(qū)域。

2A肽是來源于病毒的短肽（?18-25個氨基酸），它們通常被稱為“自我剪切”肽，能使一條轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生多種蛋白。2A肽并不是完全的“自我剪切”，而是通過使核糖體跳過2A元件C-末端的甘氨酸和脯氨酸肽鍵的合成而發(fā)揮作用，最終導(dǎo)致2A序列末端和下游產(chǎn)物分離。其中，上游蛋白的C端將會添加一些額外的2A殘基，而下游蛋白的N端將會有額外的脯氨酸。目前有四種常用的2A肽，分別是P2A，T2A，E2A和F2A，來源于四種不同的病毒。

兩種連接子（linkers）的優(yōu)缺點

IRES優(yōu)于2A肽的關(guān)鍵優(yōu)勢在于它不影響上下游ORF的蛋白序列。

IRES的主要缺點是與上游ORF相比，下游ORF的表達(dá)水平比較低（通常為上游的10%-20%）。這就是為什么當(dāng)人們在IRES后表達(dá)熒光蛋白時，常常難以獲得可檢測的熒光信號，特別是在體內(nèi)應(yīng)用。此外，IRES元件的大?。?gt;500 bp）也可能會增加載體構(gòu)建和病毒包裝的難度。

2A肽優(yōu)于IRES的關(guān)鍵優(yōu)勢在于下游ORF的表達(dá)水平與上游ORF相當(dāng)（或者略小于）。

2A肽的缺點可能是會在上下游ORF留下附加殘基，從而可能產(chǎn)生不良影響。2A肽的自我切割并不是100％有效的，其效率會受上下游ORF序列的影響。因此，不能進(jìn)行有效自我切割的融合蛋白將會是一種翻譯產(chǎn)物，在某些實驗運用中，這是一個值得注意的問題。

如果您的實驗不需要第二個ORF的高水平表達(dá)（如藥物篩選標(biāo)記），那么IRES應(yīng)該是可以滿足實驗要求的。然而，如果多順反子中存在兩個以上的ORF，或者等量共表達(dá)多個ORF很重要，我們建議您使用2A肽。

不同2A肽的比較

在四種常用的2A肽（P2A，T2A，E2A和F2A）中，P2A通常具有最高的切割效率（在某些情況下接近100％），接下來是T2A，其次是E2A和F2A。F2A的切割效率僅為約50％，我們通常推薦在多順反子中使用P2A或T2A。

參考文獻(xiàn)

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