質(zhì)粒上的復(fù)制起點(diǎn)屬于低拷貝型

質(zhì)粒的拷貝數(shù)是由質(zhì)粒上的復(fù)制起點(diǎn)決定的，有的復(fù)制起始點(diǎn)屬于低拷貝型。請(qǐng)確認(rèn)質(zhì)粒上復(fù)制起點(diǎn)類(lèi)型。對(duì)于低拷貝質(zhì)粒，則需要擴(kuò)大細(xì)菌培養(yǎng)量以獲得足夠的質(zhì)粒DNA。

進(jìn)一步了解VectorBuilder不同載體復(fù)制起點(diǎn)拷貝數(shù)

用于質(zhì)粒提取的菌量過(guò)少

請(qǐng)檢查確認(rèn)質(zhì)粒制備柱的結(jié)合容量以及您的質(zhì)粒是高拷貝還是低拷貝質(zhì)粒。對(duì)于小量提取，我們建議您收集1-5 ml過(guò)夜培養(yǎng)菌液。對(duì)于大量提取，如果質(zhì)粒是高拷貝，我們推薦使用100-150 ml過(guò)夜培養(yǎng)菌液；如果是低拷貝，我們推薦使用300-500 ml過(guò)夜培養(yǎng)菌液。一般情況下，對(duì)于高拷貝質(zhì)粒，1 ml的過(guò)夜培養(yǎng)菌液可以小量提取?5 ug的質(zhì)粒DNA，150 ml的過(guò)夜培養(yǎng)菌液可以提取?500 ug的質(zhì)粒DNA；對(duì)于低拷貝質(zhì)粒（如pET），1 ml過(guò)夜培養(yǎng)菌液可以小量提取1.5-2.5 μg質(zhì)粒DNA，150 ml過(guò)夜培養(yǎng)菌液可以提取150-200 μg質(zhì)粒DNA。

只有小部分菌體含有質(zhì)粒

有的抗生素，尤其是氨芐青霉素，在液體培養(yǎng)中會(huì)快速降解，導(dǎo)致不含質(zhì)粒的細(xì)菌可以大量繁殖，最終使得質(zhì)粒制備產(chǎn)量低。為了避免這種情況，請(qǐng)?jiān)谑褂们靶迈r制備含氨芐青霉素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并確保提供足夠的濃度。另外，在培養(yǎng)具有氨芐抗性的細(xì)菌時(shí)，請(qǐng)不要讓菌液飽和培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。因?yàn)殡S著培養(yǎng)時(shí)間的增加，培養(yǎng)基的抗生素會(huì)越來(lái)越少，許多細(xì)菌細(xì)胞也已死亡且它們所含的質(zhì)粒DNA會(huì)被降解，所以從過(guò)飽和培養(yǎng)的菌液中提取的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量會(huì)低。請(qǐng)從新鮮菌液提取質(zhì)粒DNA，如果不能立即進(jìn)行質(zhì)粒制備，則可以將菌體離心沉淀，并儲(chǔ)存于-80°C冰箱中備用。

直接取甘油菌進(jìn)行接菌培養(yǎng)

直接將從VectorBuilder收到的甘油菌或穿刺菌進(jìn)行接種，可能會(huì)偶爾出現(xiàn)質(zhì)粒制備產(chǎn)量低的情況。我們建議先在含有適當(dāng)抗生素的LB平板上劃線，然后挑取單菌落接種到含有相應(yīng)抗生素的新鮮液體培養(yǎng)基中。具體操作說(shuō)明請(qǐng)?jiān)诓藛螜?ldquo;學(xué)習(xí)中心”>“資料下載”> “甘油菌”進(jìn)行查看。

沒(méi)有正確使用質(zhì)粒提取試劑盒

請(qǐng)?jiān)谑褂们白屑?xì)閱讀質(zhì)粒制備試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，防止不當(dāng)操作。

質(zhì)粒制備柱質(zhì)量較差

某些品牌的質(zhì)粒DNA制備柱質(zhì)量較差，請(qǐng)及時(shí)檢測(cè)更換相應(yīng)試劑盒。