圖1 優(yōu)化的UTR改善mRNA表達(dá)效率。高斯熒光素酶mRNA使用不同的UTR組合表現(xiàn)出不同的表達(dá)水平。在12孔板中接種293T細(xì)胞，細(xì)胞密度2.3×10⁵ 細(xì)胞/孔。每孔轉(zhuǎn)染1 ug mRNA。轉(zhuǎn)染后6 h、24 h、48 h、72 h以及96 h，取20 ul細(xì)胞測(cè)定高斯熒光素酶活性。

圖2 對(duì)編碼序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化提高了mRNA的體外和體內(nèi)表達(dá)水平。（A）HEK293T細(xì)胞中表達(dá)HiExpress^TM螢火蟲(chóng)熒光素酶IVT mRNA以及其它版本的熒光素酶mRNA。細(xì)胞生長(zhǎng)于12孔板，每孔轉(zhuǎn)染0.5 ug mRNA。轉(zhuǎn)染后6 h、24 h、48 h以及72 h測(cè)定熒光素酶活性。（B）向C57BL/6成年小鼠肌肉注射30 ug LNP包封的熒光素酶mRNA，注射后6 h、24 h、48 h測(cè)定熒光素酶活性。Fluc WT表示野生型熒光素酶mRNA。Fluc WT (co)表示經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的熒光素酶mRNA。Fluc2表示luc2熒光素酶mRNA。HiExpress^TM Fluc表示云舟生物HiExpressTM螢火蟲(chóng)熒光素酶IVT mRNA。

圖3 polyA長(zhǎng)度分析。使用核糖核酸酶將polyA尾巴從mRNA上切割下來(lái)，然后進(jìn)行oligo dT親和色譜純化，LS-MS分析核苷酸信息。（A）基于尿素PAGE的polyA大小分析。變性尿素PAGE電泳mRNA酶切后的60 ng 120 nt和150 nt的polyA尾巴。（B）基于LC-MS 的polyA大小分析。120 nt長(zhǎng)度的120 p mol polyA分子量的逆卷積質(zhì)譜結(jié)果。（C）期望為120 nt的polyA尾巴長(zhǎng)度觀測(cè)分布。柱狀圖表明polyA長(zhǎng)度的同一性較好。誤差線表示3次酶切試驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差。polyA加權(quán)平均長(zhǎng)度為123 nt。

圖4 不同polyA尾巴長(zhǎng)度、但是Cap1和UTR相同的IVT EGFP mRNA轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。

圖 5. 完整性良好的長(zhǎng)序列IVT mRNA。使用變性凝膠電泳鑒定云舟生物不同批次的IVT mRNA。在不同體外轉(zhuǎn)錄條件下均能獲得長(zhǎng)度 >10,000 nt的序列完整的IVT mRNA。 

圖6 基于LC-MS的加帽效率分析。（A）共轉(zhuǎn)錄法和（B）酶加法均能實(shí)現(xiàn)很高的加帽效率。

圖7 修飾的核苷酸增強(qiáng)mRNA表達(dá)，同時(shí)減少dsRNA產(chǎn)生。（A）293T細(xì)胞中表達(dá)螢火蟲(chóng)熒光素酶IVT mRNA。使用的mRNA包括無(wú)修飾的、N1-甲基假尿苷（N1-methylpseudouridine，m1Ψ）修飾的、5-甲基胞苷（5-methylcytidine，m5C）修飾的，以及m1Ψ/m5C修飾的。細(xì)胞生長(zhǎng)于12孔板，每孔轉(zhuǎn)染1 ug mRNA。293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染螢光素酶mRNA后6 h、24 h、48 h的螢光素酶活性。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。平均熒光強(qiáng)度使用帶顏色的柱狀圖表示。(B) 等量修飾的和無(wú)修飾的EGFP IVT mRNA（每斑點(diǎn)750 ng）經(jīng)過(guò)磁柱純化，使用斑點(diǎn)雜交估測(cè)dsRNA雜質(zhì)含量。

殘留dsRNA是IVT產(chǎn)物中主要引起免疫反應(yīng)的雜質(zhì)。 斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)結(jié)果表明額外的純化步驟毒藥去除殘留dsRNA至關(guān)重要。

圖8 不同純化方式的dsRNA去除效率。不同的純化方式純化等量的hSpCas9 IVT mRNA（每斑點(diǎn)1500 ng），然后使用斑點(diǎn)雜交估測(cè)殘留dsRNA?？s寫(xiě)：HIC，Hydrophobic interaction chromatography；IP-RP，Ion-pair reversed-phase liquid chromatography。