CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲除可以在靶位點創(chuàng)造DNA雙鏈斷裂（DSB），再通過細胞的非同源末端連接（NHEJ）進行修復(fù)，導(dǎo)致永久突變 ，如在修復(fù)位點產(chǎn)生小插入或缺失。某些突變會產(chǎn)生移碼，終止密碼子提前出現(xiàn)等，從而導(dǎo)致靶基因功能缺失。

此時使用qPCR檢測敲除后的靶基因表達水平，仍有可能檢測到該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA分子。這是因為編碼基因的mRNA降解效率受諸多因素影響，比如敲除后的提前終止密碼子與起始密碼子的距離過短，無意義機制介導(dǎo)的mRNA降解（NMD）效率將顯著降低，此時細胞中的mRNA水平表現(xiàn)出沒有非常明顯的下降，導(dǎo)致qPCR結(jié)果無法印證DNA水平的基因敲除效果。

在蛋白水平上，如果蛋白在翻譯階段跳過了被敲除的外顯子，蛋白仍然可以表達，特別是對于分子量較大的蛋白，一個大小很小的外顯子被編輯后，WB上無法觀察到顯著的區(qū)別。此外細胞也具有翻譯重起始機制（Reinitiation），當(dāng)該機制激活時，也將補償被編輯的蛋白表達。這些因素都將導(dǎo)致WB無法印證基因敲除的效果。