為了確定哪種方法最適合您的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，以下是您應(yīng)該考慮的一些事項(xiàng)。

基本原理

• 基因敲低載體

基因敲低載體表達(dá)shRNA抑制靶基因的mRNA，通過(guò)引發(fā)mRNA的切割抑制翻譯過(guò)程。shRNA敲低不改變靶基因的DNA序列。

• 基因敲除載體

CRISPR和TALEN都是通過(guò)指導(dǎo)核酸酶切割基因組中的特定靶位點(diǎn)來(lái)發(fā)揮作用。然后這些切割位點(diǎn)被細(xì)胞低效地修復(fù)，從而導(dǎo)致修復(fù)部位的永久性突變，比如產(chǎn)生基因的小片段插入或堿基缺失。這類突變的一部分會(huì)導(dǎo)致基因的閱讀框移碼、出現(xiàn)提前終止密碼子等，最終導(dǎo)致目的基因的功能喪失。如果同時(shí)靶向基因組中兩個(gè)相鄰緊密的切割位點(diǎn)（距離幾個(gè)kb），也可以導(dǎo)致其間區(qū)域的刪除。

效率

shRNA敲低永遠(yuǎn)不會(huì)完全抑制靶基因的表達(dá)。即使對(duì)于最有效的shRNA，靶基因的一些殘留表達(dá)也會(huì)保留。相比之下，在一小部分經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞群中，CRISPR和TALEN可以產(chǎn)生永久性突變，這可能導(dǎo)致基因功能完全喪失。

一致性和均一性

shRNA載體通常在轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞時(shí)獲得較好的均一性，實(shí)驗(yàn)之間的一致性也較佳。相比之下，由于引入突變是隨機(jī)的，CRISPR和TALEN的基因編輯效果在細(xì)胞之間的差異相當(dāng)大。為了完全敲除細(xì)胞中的目的基因，必須敲除細(xì)胞中基因的所有拷貝。鑒于正常細(xì)胞具有任何基因的兩個(gè)拷貝（X或Y連鎖基因除外），而癌細(xì)胞可以具有兩個(gè)以上的拷貝，這種完全敲除的細(xì)胞可能只占所有處理后的細(xì)胞的一小部分。出于這個(gè)原因，核酸酶介導(dǎo)的敲除實(shí)驗(yàn)需要通過(guò)測(cè)序來(lái)篩選克隆，以確定所有目的基因拷貝都被敲除的子細(xì)胞群。

脫靶效應(yīng)

已有報(bào)道表明shRNA介導(dǎo)的基因敲低和核酸酶介導(dǎo)的基因敲除均會(huì)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。脫靶效應(yīng)的表征可以通過(guò)使用多個(gè)不同的shRNA 靶向同一基因來(lái)評(píng)估。如果一個(gè)基因被在多個(gè)不同的shRNA作用下仍然表現(xiàn)出一致的表征，則這種表征通常則不是脫靶效應(yīng)帶來(lái)的。對(duì)于CRISPR或TALEN基因敲除，應(yīng)分析含有功能喪失突變的多個(gè)克隆，以包含可能由脫靶突變引起的任何表征。此外，可以對(duì)克隆進(jìn)行脫靶位點(diǎn)測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)方法鑒定以查看它們是否已發(fā)生突變。