云舟生物的基因敲入穩(wěn)轉細胞株可實現對細胞基因組靶位點的永久敲入。我們的基因敲入細胞采用CRISPR相關技術制備，需要針對轉導細胞的靶位點導入一個特異性的gRNA/Cas9 RNP復合物，以及一個可通過HDR修復方式引入供體序列的供體載體。我們擁有一系列獨特的技術，可讓我們在很短的周期內實現具有高HDR率的高效基因遞送，高成功率獲得敲入純合子。
亮點：
圖1 基因敲入穩(wěn)轉細胞株的構建流程。
| 服務 | 交付內容 | 價格(CNY) | 周期 |
|---|---|---|---|
| 基因敲入細胞穩(wěn)轉株構建（插入片段<3 kb） | 一個單克隆細胞株（>106個細胞/管, 2管） | ￥40,980起 | 14-20周 |
| 兩個單克隆細胞株（>106個細胞/管, 每個克隆各2管） | 請咨詢 | ||
| 基因敲入細胞穩(wěn)轉株構建（插入片段>3 kb） | 一個單克隆細胞株（>106個細胞/管, 2管） | ￥67,980起 | 16-24周 |
| 兩個單克隆細胞株（>106個細胞/管, 每個克隆各2管） | 請咨詢 | ||
* 增加交付單克隆數將收取額外費用。
| 試驗項目 | 方法 |
| 基因敲入驗證（默認） | 基因型PCR、Sanger測序 |
| 表達測試（額外收費） | RT-qPCR、WB、IF、FACS |
| 脫靶效應分析（額外收費） | NGS、PCR、Sanger測序 |
| 染色體分析（額外收費） | 核型分析 |
| 無菌測試（默認） | PCR檢測支原體、生物負荷檢測等 |
圖2 CRISPR介導的iPSC基因敲入。通過電轉法向iPSC中導入Cas9/gRNA RNP復合物和供體載體，成功敲入UBC驅動表達的EGFP（2432 bp）。（A）Sanger測序確認EGFP成功敲入靶位點。（B）基因型PCR分析四個敲入純合子的單克隆。野生型（WT）靶點的長度為762 bp，敲入了EGFP的靶點的長度為3194 bp。（C）顯微鏡下的成功敲入的細胞具有EGFP熒光。（D）核型分析結果。（E）EGFP敲入的iPSC中多能性標記物（NANOG、OCT4和SOX2）的免疫熒光結果。
基因敲除依賴于非同源末端連接 (NHEJ) 介導的 CRISPR 引起的DNA雙鏈斷裂 (DSB) 修復，該機制容易出錯，移碼或片段刪除（使用雙 gRNA 時）等突變會以一定頻率發(fā)生，導致目標基因功能喪失。另一方面，基因敲入則依賴于同源定向修復（HDR）機制，可將供體片段精確插入靶位點，其效率比NHEJ低，且僅限用于分裂細胞。此外，HDR效率也因細胞類型而異。因此，基因敲入在技術上比基因敲除更具挑戰(zhàn)性。
選擇供體模板的首要考慮因素是您的模板大小。對于小片段插入（<10 kb）,ssODN通常是最佳的選擇，其HDR效率較高。對于大片段，可因情況選擇使用線性dsDNA（細胞毒性較高，HDR率高）或者環(huán)狀質粒載體（細胞耐受性好，HDR率低）。
藥篩后獲得陽性轉導的混合細胞群。采用血細胞計數板等工具確定細胞數量和濃度。對細胞進行梯度稀釋，然后在96孔板中培養(yǎng)，并使其濃度為<1 細胞/孔。單獨的細胞克隆將被分離并擴增，對其進行基因型鑒定。
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