運(yùn)輸與存儲(chǔ)

我們的RABV病毒保存于HBSS緩沖液，并以干冰形式運(yùn)輸。接收到病毒后，RABV可以在-80°C長期存儲(chǔ)（可至少穩(wěn)定存儲(chǔ)6個(gè)月），或者在-20°C存儲(chǔ)一周。RABV的保質(zhì)期約為1年。請避免反復(fù)凍融RABV以避免顯著的滴度下降。

RABV制備與質(zhì)量控制

RABV包裝流程如圖2所示。攜帶GOI的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、分別攜帶RABV G、N、P、L基因的包裝質(zhì)粒、以及一個(gè)表達(dá)T7 RNA聚合酶的質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞。包裝質(zhì)粒表達(dá)的病毒蛋白對于含有目的基因的病毒顆粒組裝是必須的。制備覆蓋有G糖蛋白的RABV后，收集細(xì)胞上清，再次感染包裝細(xì)胞。此時(shí)若同時(shí)轉(zhuǎn)染一個(gè)表達(dá)異源包膜蛋白的質(zhì)粒（比如表達(dá)EnvA），則可以獲得假型化的RABV病毒。對于非純化的RABV病毒（體外應(yīng)用級別），使用超速離心法濃縮純化。對于超純化的RABV病毒（體內(nèi)應(yīng)用級別），使用蔗糖密度梯度離心法濃縮純化。我們使用噬斑法檢測滴度。

圖2 典型的RABV包裝流程。

對于每一個(gè)生產(chǎn)的重組RABV病毒，質(zhì)量控制包括滴度檢測、無菌測試、支原體檢測等。如果RABV病毒載體表達(dá)熒光蛋白，則我們會(huì)進(jìn)行熒光轉(zhuǎn)導(dǎo)測試。如果RABV病毒載體含有藥篩標(biāo)記，我們也會(huì)在轉(zhuǎn)導(dǎo)測試后伴隨進(jìn)行藥篩測試。此外，對于超純化RABV，我們會(huì)進(jìn)行內(nèi)毒素檢測。

試驗(yàn)驗(yàn)證

我們的RABV經(jīng)詳盡驗(yàn)證可以有效轉(zhuǎn)導(dǎo)多種細(xì)胞類型，包括表達(dá)TVA受體的細(xì)胞 （圖3）

圖3 表達(dá)EGFP的RABV轉(zhuǎn)導(dǎo)293T細(xì)胞（表達(dá)或無表達(dá)TVA）。轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時(shí)使用熒光顯微鏡成像。放大倍數(shù)：100×。左：明場。右：EGFP。

RABV背景知識

RABV是一種負(fù)鏈RNA病毒，屬于彈狀病毒科。RABV基因組長度約為12 kb，可以插入3-5 kb的轉(zhuǎn)基因片段。該病毒使用G糖蛋白來識別通常在神經(jīng)元軸突末端發(fā)現(xiàn)的各種受體。野生型RABV一旦進(jìn)入軸突末端，病毒就會(huì)逆行傳輸?shù)郊?xì)胞體，并在那里進(jìn)行復(fù)制。RABV的病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄均發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，最大限度地減少了整合宿主基因組的風(fēng)險(xiǎn)，且降低了病毒生命周期對宿主機(jī)制的依賴。

復(fù)制后的病毒被隨后運(yùn)輸?shù)缴窠?jīng)元樹突，并以出芽方式釋放。這種高度嗜神經(jīng)性的病毒僅能通過化學(xué)突觸傳播到其他細(xì)胞，感染新的軸突末端，并經(jīng)由外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)繼續(xù)傳播到突觸前神經(jīng)元。

RABV載體的主要應(yīng)用

神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)展示

重組RABV主要用于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的突觸追蹤（圖4）。RABV有著逆行傳輸以及跨突觸傳播的限制，因此可實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)連接的特定可視化和調(diào)控。RABV載體通常缺失G糖蛋白基因，因此病毒在感染一級神經(jīng)元后無法傳播至其它細(xì)胞。 然而，當(dāng)病毒被引入具有G糖蛋白表達(dá)的細(xì)胞時(shí)（比如通過AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)引入），可產(chǎn)生的功能性病毒，然后傳播且只能傳播至上游二級神經(jīng)元，實(shí)現(xiàn)單突觸追蹤。

特定神經(jīng)元中的單突觸連接研究也是一種常見的實(shí)驗(yàn)需求。使用EnvA/TVA系統(tǒng)將允許病毒靶向特定神經(jīng)元：整合了EnvA包膜蛋白的假型化RABV特異性感染同時(shí)表達(dá)TVA受體以及G糖蛋白的一級神經(jīng)元。這將確保只有靶細(xì)胞被重組RABV感染，并允許對所有直接輸入進(jìn)行單突觸追蹤。

圖4 重組RABV的生產(chǎn)、轉(zhuǎn)導(dǎo)和感染。

疫苗制備

狂犬病是一種出現(xiàn)癥狀后致死率接近100%的疾病，其疫苗的開發(fā)也是一個(gè)熱點(diǎn)問題。目前滅活RABV是最常用的疫苗載體形式，但是具備自我復(fù)制能力的重組RABV疫苗載體也在被進(jìn)一步研究。 HEP-Flury毒株因其高度減毒、低致病性和較強(qiáng)的免疫原性而特別適合于該種應(yīng)用。

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