重組AAV病毒由于其多樣的組織嗜性、長時間的轉(zhuǎn)基因表達(dá)效果、非致病性以及低免疫原性等特點，作為一種基因遞送載體被廣泛用于基因治療和疫苗開發(fā)。

既有的AAV血清型存在一定的問題影響了其用于基因治療的潛力。首先，盡管現(xiàn)有的血清型提供了一系列組織嗜性以供選擇，但是在臨床應(yīng)用上仍然具有一些類型的組織是這些血清型的特異性無法覆蓋的。第二，盡管一些特定血清型的AAV可特異感染靶組織，但是其基因遞送效率可能偏低，或者具有脫靶效應(yīng)感染其他組織。第三，體內(nèi)預(yù)先存在針對多種AAV血清型的中和抗體將從一開始或者多次給藥后阻礙AAV的感染。最后，一些AAV血清型類型相比其它類型更難在生產(chǎn)中獲得高的滴度、純度和穩(wěn)定性。為克服這些問題，AAV衣殼開發(fā)在加速獲得新型AAV突變體、改善AAV性能方面一直是相當(dāng)重要的技術(shù)。

定向進(jìn)化是一種常用于提高生物大分子性能的高通量方法。該方法模擬自然選擇過程并將其所耗時間大幅縮短。AAV衣殼定向進(jìn)化通過突變野生型AAV衣殼基因，獲得具備高度多樣性的AAV衣殼文庫，然后從中篩選出全新的、性能更優(yōu)越的AAV衣殼。由于定向進(jìn)化不需要具備蛋白結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)的先驗知識，因此在新型AAV衣殼開發(fā)上相對于理論設(shè)計方式更具優(yōu)勢。

如何獲取AAV衣殼定向進(jìn)化CRO服務(wù)？

關(guān)于CRO項目的服務(wù)咨詢請發(fā)郵件至service@vectorbuilder.cn。如果您有更多相關(guān)問題，請點擊聯(lián)系我們。

服務(wù)亮點

• 全方面的服務(wù)平臺：載體家是當(dāng)前全球唯一一家具備AAV臨床前、臨床CRO和CDMO一站式服務(wù)的企業(yè)。我們的AAV相關(guān)服務(wù)涵蓋載體設(shè)計、載體優(yōu)化、載體克隆、文庫構(gòu)建、病毒包裝、衣殼定向進(jìn)化和工程改造、AAV組織分布鑒定、GMP病毒生產(chǎn)等。
• 多策略定向進(jìn)化構(gòu)建衣殼高度多樣性的病毒文庫：我們在文庫構(gòu)建方面的豐富經(jīng)驗，可以幫助您通過定向進(jìn)化以及其結(jié)合方法進(jìn)行自定義設(shè)計，以獲得極具病毒衣殼多樣性的文庫。
• 文庫病毒高滴度包裝：我們可使用一步法或兩步法包裝文庫病毒，并保證每種衣殼或基因組發(fā)生突變的病毒均具有很高的滴度。
• 使用包括非人靈長類（Non-human primate，NHP）在內(nèi)的多種模式生物進(jìn)行體內(nèi)篩選：除了進(jìn)行體外篩選，我們還提供一系列模式生物用于進(jìn)行體內(nèi)篩選，如小鼠、大鼠、以及重要的兩種非人靈長類：食蟹猴（Macaca fascicularis）和獼猴（Macaca Mulatta）。所有體內(nèi)篩選試驗均在經(jīng)過AAALAC認(rèn)證的機構(gòu)中以專業(yè)認(rèn)可的方式進(jìn)行。
• 完善的技術(shù)支持：我們的科學(xué)家在AAV衣殼開發(fā)項目上具有深厚的經(jīng)驗，能夠為您提供全面的技術(shù)支持，包括從文庫設(shè)計、文庫構(gòu)建到體內(nèi)篩選以及NGS分析。

衣殼進(jìn)化和篩選流程

實施AAV衣殼定向進(jìn)化的第一步也是最關(guān)鍵一步是制備高度多樣性的AAV轉(zhuǎn)移載體文庫，每個載體上包含一個嵌合型AAV基因組：含有一個rep基因和一個突變cap基因。現(xiàn)今已有多種方式可以高效制備這種突變cap基因，比如易錯PCR（Error-prone PCR）、隨機多肽展示（Random peptide display）、家族DNA洗牌（DNA family shuffling）、以及計算機設(shè)計（In silico design）等。轉(zhuǎn)移載體被包裝成病毒顆粒，每個病毒顆粒的基因組包含一個突變cap基因。文庫中這些混雜的嵌合型病毒隨后被篩選并測試以下方面：一、高效轉(zhuǎn)導(dǎo)特定組織或器官的靶細(xì)胞；二、高度親和細(xì)胞特異性表面受體；三、能夠逃避中和抗體。經(jīng)過篩選后的的病毒基因組從靶細(xì)胞中復(fù)原，然后被用于構(gòu)建一個新的更小的文庫用于第二輪篩選，并在多個篩選周期后得到某種富集的突變型衣殼。該基因克隆經(jīng)過驗證即認(rèn)為發(fā)現(xiàn)了一種新型的具有更強性能的變異AAV衣殼（圖1）。

圖1 AAV衣殼定向進(jìn)化的典型篩選流程

定向進(jìn)化構(gòu)建衣殼文庫

以下策略常用于制備突變型AAV衣殼。用于篩選的衣殼文庫通過大規(guī)模并行克隆AAV載體獲得。這些載體均包含了嵌合型的AAV基因組（每個載體包含一個rep基因和一個突變cap基因）。

易錯PCR

易錯PCR是最直接用于開發(fā)高度多樣化的AAV衣殼的選擇，這其中包括從修改標(biāo)準(zhǔn)PCR方法到突變AAV衣殼基因等多種方式。更具體而言，易錯PCR結(jié)合了多種次優(yōu)化的PCR條件，如使用低保真性聚合酶、更長的延伸時間、更高的Mg²⁺濃度、添加Mn²⁺，以及使用不相等的多種dNTP濃度等方式來對AAV衣殼基因引入隨機突變。

隨機多肽展示

隨機多肽展示通常使用7到9個隨機多肽序列插入到AAV衣殼蛋白序列的特定位點，以達(dá)到改變病毒與特定細(xì)胞表面受體的天然相互作用的目的。插入的多肽一般位于AAV衣殼暴露此段多肽的位置或者介導(dǎo)病毒與細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵位置。例如，AAV2衣殼蛋白的587位到588位氨基酸（位于VRIII可變區(qū)）是一個適用于AAV2多肽展示文庫的插入位點。在此位點插入多肽可以阻礙與AAV2作用的硫酸類肝素多糖蛋白（Heparan sulfate proteoglycan, HSPG）模體的功能（HSPG是識別AAV2的主要細(xì)胞表面受體），并促進(jìn)展示的多肽與細(xì)胞表面分子相互作用。

家族DNA洗牌

家族DNA洗牌是一種通過不同AAV血清型的親本衣殼基因分子雜交產(chǎn)生嵌合AAV衣殼的高效方法。為了實現(xiàn)這一點，將不同AAV血清型的親本衣殼基因碎片化，然后通過無引物PCR利用部分序列同源性將其重組為新型AAV衣殼。作為一種替代策略，還可以通過綜合洗牌法與其他設(shè)計方法創(chuàng)建高復(fù)雜性的文庫，即將理論設(shè)計（基于AAV生物學(xué)的先驗知識修改衣殼序列）與定向進(jìn)化相結(jié)合。在這種方法中，為發(fā)現(xiàn)和評估適合進(jìn)行突變的衣殼位點，將首先對天然血清型的AAV衣殼的精細(xì)結(jié)構(gòu)和序列進(jìn)行分析。這些含有突變的基因碎片最后將合成為全長序列，并用于組裝新型AAV衣殼。

計算機設(shè)計

現(xiàn)今已有多種計算機方法可用于預(yù)測促使AAV性能得到加強的衣殼序列。其中一個常用的方法是祖先衣殼重建，涉及多個計算機設(shè)計的祖先AAV衣殼文庫的構(gòu)建，然后進(jìn)行實驗驗證以發(fā)現(xiàn)組織嗜性得到改進(jìn)的衣殼序列。該方法背后的機理在于經(jīng)自然選擇留下的AAV進(jìn)化中間體大概率上已演化出獨特的性狀，并且仍然能維持病毒的結(jié)構(gòu)和功能。另一方面，機器學(xué)習(xí)則是另一種廣泛使用的計算機設(shè)計方法，根據(jù)輸入的大量蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系數(shù)據(jù)來預(yù)測新型AAV病毒衣殼的組裝。

衣殼文庫的病毒包裝

衣殼文庫的病毒包裝可以劃分為一步法或者兩步法，如下所述：

一步法包裝衣殼文庫

包裝AAV衣殼文庫的傳統(tǒng)方法是采用一步法：衣殼文庫和腺病毒輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞。雖然這種方法被廣泛使用，但它確實存在交叉包裝（具備衣殼變異體的AAV顆粒其基因組和衣殼類型不匹配）和衣殼鑲嵌（AAV的衣殼組分來源于多種變異體）的缺點。為了克服這些問題，建議以極低的文庫質(zhì)粒數(shù)/細(xì)胞數(shù)比率轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，以確保每個細(xì)胞至多吸收一個文庫質(zhì)粒。

兩步法包裝衣殼文庫

在兩步法包裝中，衣殼文庫首先與編碼野生型衣殼基因但缺少病毒ITR的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至包裝細(xì)胞中。這將產(chǎn)生帶有鑲嵌型衣殼的AAV顆粒，這種部分由野生型VP蛋白組成的衣殼被稱為AAV轉(zhuǎn)移穿梭機（AAV transfer shuttle）。將此種AAV以低感染復(fù)數(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞，以實現(xiàn)每個細(xì)胞至多感染一個病毒顆粒。隨后用野生型腺病毒對包裝細(xì)胞進(jìn)行雙重感染，最終產(chǎn)生高滴度病毒衣殼文庫。

體外與體內(nèi)文庫篩選

為獲得帶有期望性狀的嵌合型AAV，根據(jù)篩選目的病毒衣殼文庫通常需要經(jīng)過在體外或者體內(nèi)的多次篩選：

體外篩選

利用已建立的細(xì)胞系篩選AAV衣殼文庫是一種常用的體外篩選方法，特別是用于發(fā)現(xiàn)靶向受體能力發(fā)生變化的衣殼突變型AAV。AAV文庫的體外篩選快速且技術(shù)簡單，但是也存在一定的問題。首先，針對體外高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率優(yōu)化的載體在體內(nèi)使用時可能無法重現(xiàn)相同的效率。其次，在體外表現(xiàn)出對靶細(xì)胞高度特異性的AAV載體在體內(nèi)時可能會轉(zhuǎn)導(dǎo)非靶組織。體外篩選AAV文庫的另一種策略是在感染靶細(xì)胞之前，將AAV文庫加入免疫動物的強效血清中以辨別具有免疫逃避屬性的突變型衣殼。然而，在體內(nèi)實驗時衣殼突變的AAV引發(fā)免疫反應(yīng)類型可能并不一致（即使同樣的AAV載體，通過不同途徑輸送也可能會產(chǎn)生不同的免疫反應(yīng)）。

體內(nèi)篩選

體內(nèi)動物模型為篩選AAV文庫提供了更可靠的平臺，特別是用于尋找那些需要轉(zhuǎn)導(dǎo)體外難以培養(yǎng)的細(xì)胞的或者需要轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)雜組織結(jié)構(gòu)中的特定細(xì)胞的AAV突變體。體內(nèi)篩選還有助于發(fā)現(xiàn)與AAV突變體相關(guān)的任何的潛在脫靶效應(yīng)。小鼠和NHP均廣泛用于AAV文庫的體內(nèi)篩選，但是NHP模型由于與人類的高度相似，因此是篩選與臨床應(yīng)用相關(guān)的改良型AAV載體的最佳平臺。