重組腺相關(guān)病毒（AAV）是一種在體外或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均被廣泛使用的病毒載體。AAV可以轉(zhuǎn)導(dǎo)大量類型的哺乳動物細(xì)胞，并且在人體中表現(xiàn)為無致病性和低免疫原性，這些特點(diǎn)使其成為當(dāng)前應(yīng)用于基因治療領(lǐng)域中其中一種最高效的基因遞送載體。云舟生物提供高質(zhì)量的AAV病毒包裝服務(wù)，可以滿足AAV基因治療相關(guān)的實(shí)驗(yàn)需求。我們開發(fā)出一系列專有技術(shù)，從病毒滴度、純度、活性以及一致性等方面顯著提升了AAV病毒包裝工藝水平，特別是經(jīng)由我們設(shè)計(jì)的AAV載體。我們的AAV病毒具有良好的客戶評價。我們除了可以提供科研級的AAV病毒包裝服務(wù)外，還可以提供用于臨床應(yīng)用的GMP級別AAV制備服務(wù)。
訂購信息
ssAAV
scAAV
昆蟲桿狀病毒生產(chǎn)AAV
科研級Plus AAV
科研級AAV病毒包裝
我們的科研級AAV病毒包裝服務(wù)可以滿足多樣的AAV基因遞送實(shí)驗(yàn)需求。您可以選擇三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法包裝AAV或者使用昆蟲桿狀病毒生產(chǎn)AAV。
| 生產(chǎn)規(guī)格 | 應(yīng)用 | 最小滴度 | 分裝 | 價格（CNY） | 周期 |
| ssAAV病毒?量制備 | 細(xì)胞培養(yǎng) | > 2x1011 GC/ml | 10x25 ul | ￥3,180.00 | 6-12天 |
| ssAAV病毒中量制備 | 10x100 ul | ￥4,680.00 |
| ssAAV病毒大量制備 | > 2x1012 GC/ml | 10x100 ul | ￥7,780.00 |
| 超純化ssAAV病毒?量制備 | 細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)應(yīng)用 | > 1013 GC/ml | 4x25 ul | ￥9,780.00 | 7-14天 |
| 超純化ssAAV病毒中量制備 | 10x50 ul | ￥13,980.00 |
| 超純化ssAAV病毒?量制備 | 10x100 ul | ￥19,980.00 |
| 超純化ssAAV病毒超?量制備 | 10x500 ul | ￥69,280.00起 | 23-33 天 |
| 超純化ssAAV病毒特?量制備 | 10x1 ml | ￥111,280.00起 | 40-50 天 |
| 其它規(guī)格 | 請咨詢 |
提示：1. GC = Genome copies。
2. AAV血清型3、4的滴度通常偏低。對于這些血清型我們保證其滴度是其它血清型最小滴度的50%。
3. 對于超純化AAV病毒，病毒顆粒經(jīng)過CsCl梯度密度離心純化。
科研級AAV病毒包裝
我們的科研級AAV病毒包裝服務(wù)可以滿足多樣的AAV基因遞送實(shí)驗(yàn)需求。您可以選擇三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法包裝AAV或者使用昆蟲桿狀病毒生產(chǎn)AAV。
| 生產(chǎn)規(guī)格 | 應(yīng)用 | 最小滴度 | 分裝 | 價格（CNY） | 周期 |
| scAAV病毒?量制備 | 細(xì)胞培養(yǎng) | > 2x1011 GC/ml | 10x25 ul | ￥3,180.00 | 6-12天 |
| scAAV病毒中量制備 | 10x100 ul | ￥4,680.00 |
| scAAV病毒大量制備 | > 2x1012 GC/ml | 10x100 ul | ￥7,780.00 |
| 超純化scAAV病毒?量制備 | 細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)應(yīng)用 | > 1013 GC/ml | 4x25 ul | ￥9,780.00 | 7-14天 |
| 超純化scAAV病毒中量制備 | 10x50 ul | ￥13,980.00 |
| 超純化scAAV病毒?量制備 | 10x100 ul | ￥19,980.00 |
| 超純化scAAV病毒超?量制備 | 10x500 ul | ￥69,280.00起 | 23-33 天 |
| 超純化scAAV病毒特?量制備 | 10x1 ml | ￥111,280.00起 | 40-50 天 |
| 其它規(guī)格 | 請咨詢 |
提示：1. GC = Genome copies。
2. AAV血清型3、4的滴度通常偏低。對于這些血清型我們保證其滴度是其它血清型最小滴度的50%。
3. 對于超純化AAV病毒，病毒顆粒經(jīng)過CsCl梯度密度離心純化。
科研級AAV病毒包裝
我們的科研級AAV病毒包裝服務(wù)可以滿足多樣的AAV基因遞送實(shí)驗(yàn)需求。您可以選擇三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法包裝AAV或者使用昆蟲桿狀病毒生產(chǎn)AAV。
| 生產(chǎn)規(guī)格 | 應(yīng)用 | 最小滴度 | 分裝 | 價格（CNY） | 周期 |
| 超純化AAV病毒?量制備 | 細(xì)胞培養(yǎng)與體內(nèi)應(yīng)用 | >5x1013 GC/ml | 10x100 ul | ￥39,200.00 | 35-49天 |
| 超純化AAV病毒中量制備 | >5x1013 GC/ml | 25x200 ul | ￥141,480.00 |
| 超純化AAV病毒?量制備 | >5x1013 GC/ml | 50x200 ul | ￥267,280.00 |
提示：1. GC = Genome copies。
2. 昆蟲桿狀病毒生產(chǎn)的AAV只可選擇以下的AAV血清型：1、2、5、6、8、9。
3. 對于超純化AAV病毒，病毒顆粒經(jīng)過CsCl梯度密度離心純化。
1. GC = Genome copies。
2. 上表的價格和周期是基于CsCl密度梯度離心的純化方法計(jì)算的。若您需要使用其它純化方法（碘克沙醇梯度密度離心、親和層析色譜、離子交換色譜等），請給我們
發(fā)送咨詢。
服務(wù)詳情
病毒類型
我們提供的AAV類型
- 單鏈AAV（Single-stranded AAV，ssAAV）和自互補(bǔ)AAV（Self-complementary AAV，scAAV）
- 多種血清型：1、 2、3、4、5、6、6.2、7、8、9、rh10、PHP.eB、PHP.S、AAV2-retro、AAV2-QuadYF和AAV2.7m8等
- AAV空殼和類病毒顆粒（Virus-like particle，VLP)
我們提供的AAV的包裝服務(wù)涵蓋以下血清型：
| 血清型 | 組織嗜性 |
| AAV1 | 平滑肌, 中樞神經(jīng)系統(tǒng), 肺, 視網(wǎng)膜, 內(nèi)耳組織, 胰腺, 心臟, 肝 |
| AAV2 | 平滑肌, 中樞神經(jīng)系統(tǒng), 肝, 腎, 視網(wǎng)膜, 內(nèi)耳組織 |
| AAV3 | 平滑肌, 肝, 肺 |
| AAV4 | 中樞神經(jīng)系統(tǒng), 視網(wǎng)膜, 肺, 腎 |
| AAV5 | 平滑肌, 中樞神經(jīng)系統(tǒng), 肺, 視網(wǎng)膜 |
| AAV6 | 平滑肌, 心臟, 肺, 脂肪組織, 肝 |
| AAV6.2 | 肺, 肝, 內(nèi)耳組織 |
| AAV7 | 平滑肌, 視網(wǎng)膜, 中樞神經(jīng)系統(tǒng), 肝 |
| AAV8 | 平滑肌, 中樞神經(jīng)系統(tǒng), 視網(wǎng)膜, 內(nèi)耳組織, 肝, 胰腺, 心臟, 腎, 脂肪組織 |
| AAV9 | 平滑肌, 肺, 肝, 心臟, 胰腺, 中樞神經(jīng)系統(tǒng), 腦，視網(wǎng)膜, 內(nèi)耳組織, 睪丸, 腎 |
| AAV-rh10 | 平滑肌, 肺, 肝, 心臟, 胰腺, 中樞神經(jīng)系統(tǒng), 視網(wǎng)膜, 腎 |
| AAV-DJ | 肝, 心臟, 腎, 脾 |
| AAV-DJ/8 | 肝, 腦, 脾 |
| AAV-PHP.eB | 中樞神經(jīng)系統(tǒng) |
| AAV-PHP.S | 外周神經(jīng)系統(tǒng) |
| AAV2-retro | 脊神經(jīng) |
| AAV2-QuadYF | 內(nèi)皮細(xì)胞 |
| AAV2.7m8 | 視網(wǎng)膜, 內(nèi)耳組織 |
| 組織 | 推薦使用的AAV血清型 |
| 平滑肌 | AAV1, AAV2, AAV3, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-rh10 |
| 中樞神經(jīng)系統(tǒng) | AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-rh10, AAV-PHP.eB |
| 外周神經(jīng)系統(tǒng) | AAV-PHP.S |
| 腦 | AAV1, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-DJ/8 |
| 視網(wǎng)膜 | AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-rh10, AAV2.7m8 |
| 內(nèi)耳組織 | AAV1, AAV2, AAV6.2, AAV8, AAV9, AAV2.7m8 |
| 肺 | AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV9, AAV-rh10 |
| 肝 | AAV1, AAV2, AAV3, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-rh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
| 胰腺 | AAV1, AAV2, AAV6, AAV8, AAV9, AAV-rh10 |
| 心臟 | AAV1, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAV-rh10, AAV-DJ |
| 腎 | AAV2, AAV4, AAV8, AAV9, AAV-rh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
| 脂肪組織 | AAV6, AAV8, AAV9 |
| 睪丸 | AAV2, AAV9 |
| 脾 | AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
| 脊神經(jīng) | AAV2-retro |
| 內(nèi)皮細(xì)胞 | AAV2-QuadYF |
注意：攜帶目的基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上的ITR序列來自于AAV2。一般來說，包裝不同血清型的AAV，指的是使用不同血清型的衣殼蛋白表達(dá)質(zhì)粒，與攜帶AAV2 ITR的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒進(jìn)行包裝。
查看不同腺相關(guān)病毒血清型病毒衣殼蛋白1（VP1）的氨基酸序列 >>
交付內(nèi)容
ssAAV
scAAV
昆蟲桿狀病毒生產(chǎn)AAV
| 非純化ssAAV制備服務(wù) | 純化ssAAV制備服務(wù) |
| 交付內(nèi)容 | 定制病毒，按照規(guī)格交付： - ?量制備：>2x1011GC/ml，10x25 ul
- 中量制備：>2x1011GC/ml，10x100 ul
- ?量制備：>2x1012GC/ml，10x100 ul
| 定制病毒，按照規(guī)格交付： - ?量制備：>1013GC/ml，4x25 ul
- 中量制備：>1013GC/ml，10x50 ul
- ?量制備：>1013GC/ml，10x100 ul
|
對照病毒，按照定制病毒的規(guī)格對應(yīng)贈送： - ?量制備：>2x1011GC/ml，100 ul
- 中量制備：>2x1011GC/ml，2x100 ul
- ?量制備：>2x1011GC/ml，2x100 ul
| 對照病毒，按照定制病毒的規(guī)格對應(yīng)選購： - ?量制備：>1013GC/ml，4x25 ul
- 中量制備：>1013GC/ml，10x50 ul
- ?量制備：>1013GC/ml，10x100 ul
|
輔助病毒，按照定制病毒的規(guī)格對應(yīng)選購： - ?量制備：>2x1011GC/ml，10x25 ul
- 中量制備：>2x1011GC/ml，10x100 ul
- ?量制備：>2x1012GC/ml，10x100 ul
| 輔助病毒，按照定制病毒的規(guī)格對應(yīng)選購： - ?量制備：>1013GC/ml，4x25 ul
- 中量制備：>1013GC/ml，10x50 ul
- ?量制備：>1013GC/ml，10x100 ul
|
| 病毒重懸液 | 50 mM Tris-based緩沖液 | pH7.4 PBS-based緩沖液 |
| 運(yùn)輸/存儲 | 干冰/-80°C，避免反復(fù)凍融 | 干冰/-80°C，避免反復(fù)凍融 |
| 推薦應(yīng)用 | 體外培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo) | 體外培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)、動物體內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo) |
對照病毒
為了更好地開展您的實(shí)驗(yàn)，我們按照“對照病毒與定制病毒的生物學(xué)應(yīng)用相匹配”的原則給您贈送或者推薦對照病毒。例如，如果定制病毒表達(dá)一個基因，則推薦的對照病毒表達(dá)熒光蛋白EGFP。如果定制病毒表達(dá)打靶某個基因的shRNA，則對照病毒表達(dá)一個Scramble shRNA。推薦的對照病毒信息如下表所示：
| 對照病毒 | 對照載體名稱 | 對照載體ID | 定制病毒 |
| EGFP對照AAV病毒 | pAAV[Exp]-CAG>EGFP:WPRE | VB010000-9287ffw | 哺乳動物基因表達(dá)AAV病毒（包含Tet-On誘導(dǎo)表達(dá)和FLEX條件性表達(dá)）、哺乳動物AAV CRISPR系統(tǒng)、哺乳動物非編碼RNA表達(dá)AAV病毒 |
| mCherry對照AAV病毒 | pAAV[Exp]-CMV>mCherry | VB900129-0800rvh |
| Scramble shRNA對照AAV病毒，EGFP熒光 | pAAV[shRNA]-CAG>EGFP-U6>Scramble_shRNA | VB010000-9489hhg | 哺乳動物shRNA干擾AAV病毒 |
| Scramble shRNA對照AAV病毒，mCherry熒光 | pAAV[shRNA]-CMV>mCherry-U6>Scramble_shRNA | VB010000-0024wah |
| Scramble miR30-shRNA對照AAV病毒，EGFP熒光 | pAAV[miR30]-CAG>EGFP:Scramble_miR30-shRNA:WPRE | VB010000-9494mnd | 哺乳動物miR30-shRNA干擾AAV病毒 |
| Tet-On EGFP 對照AAV病毒（選購） | pAAV[Tet_on]-TRE>EGFP-CBh>tTS/rtTA | VB010000-0053bwh | 哺乳動物基因Tet-On誘導(dǎo)表達(dá)AAV病毒 |
| FLEX-EGFP對照AAV病毒（選購） | pAAV[FLEX_on]-CMV>rev(EGFP) | VB180820-1044gcq | 哺乳動物基因FLEX條件性表達(dá)AAV病毒 |
輔助病毒
為了更好地開展您的實(shí)驗(yàn)，我們按照“輔助病毒與定制病毒的生物學(xué)應(yīng)用相匹配”的原則給您推薦輔助病毒。例如，如果定制病毒是一個只含TRE啟動子的TetOn慢病毒，則需要一個表達(dá)rtTA的輔助病毒，才能進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。推薦的輔助病毒信息如下表所示：
| 輔助病毒 | 輔助載體名稱 | 輔助載體ID | 定制病毒 |
| SaCas9 AAV病毒（選購） | pAAV[Exp]-CMV>saCas9 | VB010000-9382per | 哺乳動物gRNA AAV病毒（不含Cas9） |
| Cre AAV病毒（選購） | pAAV[Exp]-CMV>Cre | VB010000-9443kev | 哺乳動物基因FLEX條件性表達(dá)AAV病毒 |
| 非純化scAAV制備服務(wù) | 純化scAAV制備服務(wù) |
| 交付內(nèi)容 | 定制病毒，按照規(guī)格交付： - ?量制備：>2x1011GC/ml，10x25 ul
- 中量制備：>2x1011GC/ml，10x100 ul
- ?量制備：>2x1012GC/ml，10x100 ul
| 定制病毒，按照規(guī)格交付： - ?量制備：>1013GC/ml，4x25 ul
- 中量制備：>1013GC/ml，10x50 ul
- ?量制備：>1013GC/ml，10x100 ul
|
對照病毒，按照定制病毒的規(guī)格對應(yīng)贈送： - ?量制備：>2x1011GC/ml，100 ul
- 中量制備：>2x1011GC/ml，2x100 ul
- ?量制備：>2x1011GC/ml，2x100 ul
| 對照病毒，按照定制病毒的規(guī)格對應(yīng)選購： - ?量制備：>1013GC/ml，4x25 ul
- 中量制備：>1013GC/ml，10x50 ul
- ?量制備：>1013GC/ml，10x100 ul
|
輔助病毒，按照定制病毒的規(guī)格對應(yīng)選購： - ?量制備：>2x1011GC/ml，10x25 ul
- 中量制備：>2x1011GC/ml，10x100 ul
- ?量制備：>2x1012GC/ml，10x100 ul
| 輔助病毒，按照定制病毒的規(guī)格對應(yīng)選購： - ?量制備：>1013GC/ml，4x25 ul
- 中量制備：>1013GC/ml，10x50 ul
- ?量制備：>1013GC/ml，10x100 ul
|
| 病毒重懸液 | 50 mM Tris-based緩沖液 | pH7.4 PBS-based緩沖液 |
| 運(yùn)輸/存儲 | 干冰/-80°C，避免反復(fù)凍融 | 干冰/-80°C，避免反復(fù)凍融 |
| 推薦應(yīng)用 | 體外培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo) | 體外培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)、動物體內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo) |
對照病毒
為了更好地開展您的實(shí)驗(yàn)，我們按照“對照病毒與定制病毒的生物學(xué)應(yīng)用相匹配”的原則給您贈送或者推薦對照病毒。例如，如果定制病毒表達(dá)一個基因，則推薦的對照病毒表達(dá)熒光蛋白EGFP。如果定制病毒表達(dá)打靶某個基因的shRNA，則對照病毒表達(dá)一個Scramble shRNA。推薦的對照病毒信息如下表所示：
| 對照病毒 | 對照載體名稱 | 對照載體ID | 定制病毒 |
| EGFP對照scAAV病毒 | pscAAV[Exp]-CMV>EGFP:WPRE | VB010000-9304aud | 哺乳動物基因表達(dá)scAAV病毒 |
| Scramble shRNA對照scAAV病毒，EGFP熒光 | pscAAV[shRNA]-EGFP-U6>Scramble_shRNA | VB010000-9343nhh | 哺乳動物shRNA干擾scAAV病毒 |
| 純化AAV制備服務(wù)（通過桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)Sf9昆蟲細(xì)胞制備） |
| 交付內(nèi)容 | 定制病毒，按照規(guī)格交付： - ?量制備：>5x1013GC/ml，10x100 ul
- 中量制備：>5x1013GC/ml，25x100 ul
- ?量制備：>5x1013GC/ml，50 x 100 ul
|
對照病毒，按照定制病毒的規(guī)格對應(yīng)選購： - ?量制備：>5x1013GC/ml，10x100 ul
- 中量制備：>5x1013GC/ml，25x100 ul
- ?量制備：>5x1013GC/ml，50 x 100 ul
|
| 病毒重懸液 | pH7.4 PBS-based緩沖液 |
| 運(yùn)輸/存儲 | 干冰/-80°C，避免反復(fù)凍融 |
| 推薦應(yīng)用 | 體外培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)、動物體內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo) |
對照病毒
為了更好地開展您的實(shí)驗(yàn)，我們按照“對照病毒與定制病毒的生物學(xué)應(yīng)用相匹配”的原則給您贈送或者推薦對照病毒。例如，如果定制病毒表達(dá)一個基因，則推薦的對照病毒表達(dá)熒光蛋白EGFP。如果定制病毒表達(dá)打靶某個基因的shRNA，則對照病毒表達(dá)一個Scramble shRNA。推薦的對照病毒信息如下表所示：
| 對照病毒 | 對照載體名稱 | 對照載體ID | 定制病毒 |
| 超純化EGFP對照AAV病毒，桿狀病毒感染Sf9方法 | pBV-ITR-CMV>EGFP-ITR | VB010000-9306ded | 哺乳動物基因表達(dá)AAV病毒（通過桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)Sf9昆蟲細(xì)胞制備） |
運(yùn)輸/儲存
我們的AAV病毒存儲在特殊的Tris緩沖液或PBS緩沖液中，并采用干冰運(yùn)輸。收到AAV病毒后，立即放置于-80℃，可保存約一年。若放置于-20℃，則可保存2-3周。融解后的AAV病毒可在4℃保存1-2周。雖然AAV病毒比其他多數(shù)病毒穩(wěn)定（如慢病毒），但是也請避免反復(fù)凍融，因?yàn)檫@會導(dǎo)致AAV病毒滴度顯著下降。
不同級別的AAV比較
下表比較了我們不同級別的AAV病毒。
| 科研級（非純化） | 科研級（超純化） | 科研級Plus |
| 純化方式 | - | CsCl梯度密度離心 | CsCl梯度密度離心（默認(rèn)） 碘克沙醇梯度密度離心（可選） 親和層析色譜（可選） 離子交換色譜（可選） |
| 滴度 | > 1012 GC/ml | > 1013 GC/ml | 1013 - 5x1013 GC/ml |
| 純度（SDS-PAGE） | - | > 80% | > 90% |
| 內(nèi)毒素水平 | < 30 EU/ml | < 10 EU/ml | < 2 EU/ml |
| 完整衣殼比率 | - | > 70% | > 80% |
生產(chǎn)/質(zhì)控
三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法生產(chǎn)AAV
昆蟲桿狀病毒生產(chǎn)AAV
我們通常使用三質(zhì)粒系統(tǒng)包裝重組AAV病毒。該系統(tǒng)采用一個攜帶目的基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、一個Rep-Cap表達(dá)質(zhì)粒以及一個表達(dá)腺病毒基因（E2、E2A和VA）的輔助質(zhì)粒供轉(zhuǎn)染HEK293T包裝細(xì)胞。細(xì)胞短暫孵育后，根據(jù)血清型的不同，收集上清或者細(xì)胞裂解液，PEG濃縮獲取病毒顆粒。對于超純化AAV（體內(nèi)應(yīng)用級別），再通過氯化銫（CsCl）密度梯度離心對病毒顆粒進(jìn)一步純化和濃縮。
圖1 三質(zhì)粒法包裝AAV的典型流程
對于每一批我們生產(chǎn)的AAV病毒，我們的質(zhì)量控制包括qPCR滴度檢測、微生物負(fù)荷檢測（針對細(xì)菌、真菌）、支原體檢測等。若轉(zhuǎn)移載體同時編碼一個熒光標(biāo)記基因，我們還會將病毒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)以測定相應(yīng)的熒光表達(dá)情況。此外，對于超純化AAV病毒，我們還可以檢測內(nèi)毒素水平和使用SDS-PAGE方法檢測病毒純度。
我們的使用桿狀病毒包裝AAV的工作流程包括兩個主要步驟，如圖1所示。步驟1中產(chǎn)生兩種重組桿狀病毒，第一個表達(dá)目的基因（GOI），其兩側(cè)有AAV反向末端重復(fù)序列 (Inverted terminal repeat，ITR)，第二個則是輔助桿狀病毒表達(dá)AAV rep和cap基因。在步驟2中，通過將步驟1產(chǎn)生的兩種重組桿狀病毒共同感染昆蟲細(xì)胞來產(chǎn)生重組AAV顆粒。
為產(chǎn)生兩種重組桿狀病毒（一種表達(dá)GOI，其兩側(cè)是AAV ITR；另一種表達(dá)AAV rep/cap基因），首先需要將每種桿狀病毒的表達(dá)盒克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中。然后將桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體與表達(dá)Tn7轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至含有桿狀病毒穿梭空載體（又名桿粒）的細(xì)菌宿主中，以產(chǎn)生重組桿粒。然后將重組桿粒轉(zhuǎn)染到昆蟲Sf9細(xì)胞中。經(jīng)過短暫的孵育期，從培養(yǎng)基中收集病毒顆粒并使用蔗糖梯度密度離心進(jìn)一步濃縮。我們采用qPCR測定桿狀病毒滴度。然后將兩種重組桿狀病毒共感染昆蟲細(xì)胞中。在72-96 小時的孵育期后，從細(xì)胞裂解液和上清液中收集AAV顆粒，并通過PEG沉淀法進(jìn)行濃縮。對于超純化 AAV（體內(nèi)應(yīng)用級別），AAV病毒顆粒通過氯化銫 (CsCl) 梯度超速離心進(jìn)一步純化和濃縮。我們使用qPCR測定AAV滴度。
圖2 Baculovirus-AAV的典型生產(chǎn)流程
對于每個我們生產(chǎn)的AAV，我們的QC包括qPCR滴度測定（Titer measurement）、微生物檢測（Bioburden test，針對細(xì)菌、真菌）、支原體檢測（Mycoplasma test）等。若轉(zhuǎn)移載體同時編碼一個熒光蛋白，我們還會將病毒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)以測定相應(yīng)的熒光表達(dá)情況（Transduction test）。此外，對于超純化AAV病毒，我們還可以檢測內(nèi)毒素水平（Endotoxin test）和使用SDS-PAGE方法檢測病毒純度（Virus purity test）。
下表展示了我們可提供的AAV QC方法。
| 其它可選購的QC服務(wù) | 方法 |
| 滴度檢測 | ddPCR |
| TCID50 |
| AAV復(fù)制能力檢測 | qPCR |
| 完整衣殼/空衣殼分析 | TEM |
| CDMS |
| SV-AUC |
滴度保證
我們的滴度保證僅適用于包裝進(jìn)病毒的區(qū)域（從5’ ITR到3’ ITR）小于腺相關(guān)病毒承載限度（4.7 kb，～野生型AAV2基因組長度）的載體。超過該范圍，超出4.7 kb的那部分序列在包入衣殼時會被剪切掉，導(dǎo)致包裝出來的AAV病毒顆粒含有不完整的基因組，不僅影響ITR qPCR滴度檢測，而且影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)。此外，對于如下情況，我們同樣不能保證滴度：
- AAV血清型3和4的滴度通常偏低。對于這些血清型我們保證其滴度是其它血清型最小滴度的50%。
- 包含對包裝過程有不利影響的序列，例如毒性基因（如促凋亡基因）；破壞包裝細(xì)胞或病毒的完整性（如導(dǎo)致細(xì)胞聚集的膜蛋白）的基因 ；易于重排或者產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)的序列（如重復(fù)序列或者高GC含量序列）。
- ?戶提供的載體，因?yàn)槲覀儫o法控制載體質(zhì)量。
客戶提供載體
如需客戶提供AAV病毒載體，則請按照外來物品接收指南將載體寄送給我們。請嚴(yán)格按照我們的指南來進(jìn)行裝運(yùn)以免造成物品的任何延誤和損壞。客戶提供的所有材料均需經(jīng)過QC檢測，每一份材料附加檢測費(fèi)用。請注意，客戶提供物品接收并通過QC之后生產(chǎn)才正式開始。
試驗(yàn)驗(yàn)證
三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法生產(chǎn)的AAV
我們開發(fā)了一系列專有技術(shù)用以優(yōu)化三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法包裝AAV的效率。我們的三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法包裝的AAV在哺乳動物細(xì)胞中表現(xiàn)出很高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
圖3 向HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)18種血清型的重組AAV病毒，這些AAV病毒均使用CMV>EGFP載體（VB010000-9394npt）。轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時的EGFP表達(dá)效果如下圖所示。比例尺：100 um。
圖4 向HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)18種血清型的重組AAV病毒，這些AAV病毒均使用CMV>EGFP載體（VB010000-9394npt）。轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時，EGFP（A）的熒光強(qiáng)度中值（MFI）和（B）細(xì)胞陽性率通過流式細(xì)胞術(shù)檢測。（C）不同血清型AAV的EGFP表達(dá)效果如下圖所示。比例尺：100 um。
圖5 向Huh-7細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)18種血清型的重組AAV病毒，這些AAV病毒均使用CMV>EGFP載體(VB010000-9394npt）。轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時，EGFP（A）的熒光強(qiáng)度中值（MFI）和（B）細(xì)胞陽性率通過流式細(xì)胞術(shù)檢測。（C）不同血清型AAV的EGFP表達(dá)效果如下圖所示。比例尺：100 um。
桿狀病毒生產(chǎn)的AAV
我們開發(fā)了一系列專有技術(shù)用于優(yōu)化我們的桿狀病毒生產(chǎn)AAV的流程。我們的桿狀病毒生產(chǎn)的AAV在轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞時表現(xiàn)出良好的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
圖6 表達(dá)EGFP的桿狀病毒生產(chǎn)的AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)HEK293T細(xì)胞，血清型為AAV1和2，MOI 10000。左：明場。右：EGFP。
視頻
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文檔
使用說明書
腺相關(guān)病毒體外應(yīng)用
腺相關(guān)病毒體內(nèi)應(yīng)用
基因治療專題
心臟研究專用AAV
神經(jīng)研究專用AAV
肝臟研究專用AAV
肌肉研究專用AAV
COA
常見問題解答
| 慢病毒 | MMLV | 腺病毒 | AAV |
| 組織嗜性 | 廣泛 | 廣泛 | hAd5只感染表達(dá)CAR受體的細(xì)胞 | 取決于血清型 |
| 是否可感染非分裂細(xì)胞 | 是 | 否 | 是 | 是 |
| 病毒基因組穩(wěn)定整合抑或游離于宿主基因組 | 穩(wěn)定整合 | 穩(wěn)定整合 | 游離的DNA附加體形式 | 游離的DNA附加體形式 |
| 自定義啟動子 | 是 | 否 | 是 | 是 |
| 應(yīng)用 | 細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn) | 細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn) | 體內(nèi)實(shí)驗(yàn) | 體內(nèi)實(shí)驗(yàn) |
| 體內(nèi)免疫反應(yīng) | 低 | 低 | 高 | 非常低 |
我們通過裂解AAV病毒顆粒，然后以qPCR測定裂解產(chǎn)物中的AAV基因組拷貝數(shù)（ITR區(qū)域的拷貝數(shù)）來獲取AAV的物理滴度（Physical titer）。其他滴度測定方式如ddPCR、TCID50以選購方式提供。
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