技術(shù)詳情

突變文庫的構(gòu)建策略

芯片合成寡核苷酸

芯片合成寡核苷酸的方式非常適合用于生成的具有各種大小和序列的突變體，比如可在給定位點(diǎn)制造飽和突變。我們基于芯片的 DNA 合成長度通?？蛇_(dá)300 nt，且錯誤率較低。

易錯PCR

易錯PCR是最直接用于開發(fā)高度多樣化的突變文庫的選擇，這其中包括從修改標(biāo)準(zhǔn)PCR方法到突變AAV衣殼基因等多種方式。更具體而言，易錯PCR結(jié)合了多種次優(yōu)化的PCR條件，如使用低保真性聚合酶、更長的延伸時間、更高的Mg^₂₊濃度、添加Mn^₂₊，以及使用不相等的多種dNTP濃度等方式來對AAV衣殼基因引入隨機(jī)突變。

簡并密碼子

密碼子簡并機(jī)制允許一個氨基酸由多個密碼子編碼。通過向由寡核苷酸合成中的簡并密碼子引入了受控的、高度隨機(jī)的突變，可對可能產(chǎn)生陽性突變的區(qū)域和氨基酸進(jìn)行針對性的靶向。例如，廣泛使用的簡并密碼子突變文庫——NNK文庫，其NNK簡并引物涵蓋了32種密碼子組合（N= A/C/G/T，K= G/T），可以編碼所有20種氨基酸和一個終止密碼子。在文庫構(gòu)建中利用簡并密碼子是一種引入多樣性的有效方法。

DNA洗牌

DNA洗牌是一種通過同源重組產(chǎn)生嵌合DNA序列的高效方法。這項技術(shù)首先將親本基因切割成隨機(jī)片段，然后使用無引物的PCR技術(shù)并根據(jù)部分序列同源性進(jìn)行重組，從而將它們重新組裝成新的嵌合序列。另外，合成洗牌將合理設(shè)計與定向進(jìn)化相結(jié)合，可用于創(chuàng)建高復(fù)雜性文庫。在采用其他突變方法（如易錯PCR）后也可以進(jìn)行家族DNA洗牌。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

圖1 質(zhì)粒文庫(NNK)₁₁的核苷酸構(gòu)成

該文庫采用NNK簡并密碼子策略構(gòu)建。每根柱子代表DNA序列中不同的核苷酸位置，顏色表示觀察到的核苷酸類型。所有位置都顯示出預(yù)期的核苷酸，且觀察到的頻率接近理論值（N = 25% A + 25% T +25% G + 25% C，K = 50% T + 50% G）。

圖2 質(zhì)粒文庫7-mer可變區(qū)的氨基酸分布

該文庫利用NNK簡并密碼子策略構(gòu)建而成。每根柱子分別代表理論（綠）/實(shí)際（紅）上的特異氨基酸/終止密碼子的百分比。觀察到的20種氨基酸和終止密碼子的實(shí)際頻率與理論頻率非常接近。

圖3 云舟生物芯片合成的寡核苷酸文庫。圖示為復(fù)雜度、覆蓋率和序列比對的一致性。

數(shù)據(jù)以無偏向的方式收集于云舟生物使用芯片合成的寡核苷酸文庫。（A）這些定制文庫的大小分布高度多樣化，復(fù)雜度從10²到超過10⁵不等。（B）覆蓋率和讀取的比對率均很高接近100%，突出表明了我們文庫的極高準(zhǔn)確性和低錯誤率。