shRNA干擾或者核酸酶介導(dǎo)的基因敲除（如CRISPR、TALEN）都是在細(xì)胞水平上，研究基因缺失對功能影響的重要實驗方法。為了確定哪一種方法對您的應(yīng)用是最優(yōu)選擇，需要考慮以下幾個方面。

作用機(jī)制

• 干擾載體

  干擾載體通過表達(dá)短發(fā)夾RNA（shRNAs）來誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)mRNA的切割，抑制其翻譯，從而達(dá)到在細(xì)胞水平抑制靶mRNA的功能。因此，shRNA干擾載體不會引起靶基因DNA序列的變化。

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• 基因敲除載體

  CPISPR和TALEN都是通過引導(dǎo)核酸酶切割基因組的特定靶位點來起作用，切口被細(xì)胞機(jī)制低效修復(fù)，導(dǎo)致永久性突變，如在修復(fù)位點插入或者缺失幾個堿基。某些突變會產(chǎn)生移碼，終止密碼子提前出現(xiàn)等，從而導(dǎo)致目的基因功能缺失。如果基因組中兩個臨近的位點（如小于幾kb）同時作為靶向位點，可能會導(dǎo)致中間區(qū)域片段的缺失（即片段敲除）。

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靶向效率

shRNA介導(dǎo)的干擾不會完全抑制靶基因的表達(dá)，即使是最有效的shRNAs。相比之下，CRISPR和TALEN可以在某些細(xì)胞產(chǎn)生永久的突變從而導(dǎo)致基因功能的完全喪失。

一致性和均一性

在不同的轉(zhuǎn)染細(xì)胞間，shRNA干擾載體能夠產(chǎn)生較高的均一性和一致性。相反，CRISPR和TALEN技術(shù)由于插入突變的隨機(jī)性，細(xì)胞之間是高度不均一的。為了完全敲除靶基因，該基因的所有拷貝都必須被敲除。假設(shè)正常細(xì)胞的基因都具有兩個拷貝（除了X-或Y-連鎖基因），而癌細(xì)胞可以有多個拷貝，這種完全敲除細(xì)胞的占比是非常少的。因此，核酸酶介導(dǎo)的敲除需要通過測序篩選以確認(rèn)靶基因的所有拷貝已經(jīng)被敲除。

脫靶效應(yīng)

shRNA介導(dǎo)的干擾與核酸酶介導(dǎo)的基因敲除都具有脫靶效應(yīng)。脫靶表型可以通過使用多種不同的shRNA靶向相同的目的基因來驗證。如果同一個基因使用多個不同的shRNA干擾導(dǎo)致表型變化一致，那么說明表型改變不是由脫靶效應(yīng)引起。而對于CRISPR或TALEN基因敲除，應(yīng)當(dāng)分析多個含有功能缺失突變的克隆，以排除由于脫靶效應(yīng)導(dǎo)致的表型改變。此外，可以對生物信息學(xué)預(yù)測的脫靶位點進(jìn)行測序以確認(rèn)是否發(fā)生突變

在線設(shè)計同源重組Donor載體