對(duì)于CRISPR介導(dǎo)的基因組編輯，Cas9核酸酶靶向位點(diǎn)特異性引導(dǎo)RNA（gRNA）的靶位點(diǎn)以產(chǎn)生DNA切割。在大多數(shù)情況下，為了產(chǎn)生簡(jiǎn)單的基因敲除，可以將單個(gè)gRNA與Cas9一起使用以產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSB），并通過(guò)非同源末端連接（NHEJ）低效修復(fù)，導(dǎo)致永久突變 ，如在修復(fù)位點(diǎn)產(chǎn)生小插入或缺失。某些突變會(huì)產(chǎn)生移碼，終止密碼子提前出現(xiàn)等，從而導(dǎo)致目的基因功能缺失。如果基因組中兩個(gè)臨近的位點(diǎn)（如小于幾kb）同時(shí)作為靶向位點(diǎn)，使用雙gRNA可能會(huì)導(dǎo)致中間區(qū)域片段的缺失（即片段敲除）。

如果使用Cas9_D10A缺刻酶靶向單個(gè)靶位點(diǎn)的兩條相對(duì)鏈，則可以使用雙gRNA。缺刻酶將在兩條鏈上產(chǎn)生單鏈切割，兩條gRNA分別引導(dǎo)缺刻酶在對(duì)應(yīng)的一條鏈上進(jìn)行切割，從而引起靶位點(diǎn)處發(fā)生DSB。 通常情況下，這種方法可以減少CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)，因?yàn)樾枰獌蓚€(gè)gRNA同時(shí)打靶才能產(chǎn)生DSB。

當(dāng)使用Cas9_D10A缺刻酶和外源Donor DNA模板將特定堿基（例如敲入）引入目的基因時(shí)，也可以使用雙gRNA。兩個(gè)gRNA靶向位于所需突變位點(diǎn)側(cè)翼的兩條相對(duì)鏈，然后通過(guò)同源定向修復(fù)（HDR）的方法利用外源模板來(lái)修復(fù)被切除的序列。

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