并不是所有的shRNA都會起作用

根據(jù)我們的經(jīng)驗和來自客戶的反饋，使用3-4個shRNA進行干擾測試時，通常只有2-3個有比較合理的干擾效果。所以，在使用shRNA時，重要的是要認識到并非所有的shRNA都能正常工作。通常情況下，約50-70％的shRNA具有干擾效果，其中只有約20-30％的shRNA具有比較明顯的效果。如果您使用幾個shRNA靶向同一個基因都沒有一個能產(chǎn)生滿意的干擾效果，最好的解決方式是嘗試更多的shRNA，特別是那些經(jīng)過文獻驗證的shRNA。目前，許多研究人員使用靶向相同基因的shRNA庫（即不同shRNA的混合物）進行實驗，以期提高干擾效率。

干擾效率檢測方法不當

最常用評估shRNA干擾效率的靈敏測定方法是RT-qPCR，您可能需要嘗試幾對引物，篩選出最具特異性和效率的引物對。通常情況下，RT-qPCR引物應跨越內(nèi)含子，即設計在兩個外顯子上，以免擴增基因組DNA。當使用新引物時，建議您先進行預擴增實驗，并將PCR產(chǎn)物進行電泳檢測目的條帶，或者甚至可以通過測序驗證PCR產(chǎn)物是否正確。在進行RT-qPCR的同時，應注意設置minus-RT對照以評估基因組DNA的污染水平。您可以使用NCBI引物設計工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）來檢查引物質(zhì)量。

干擾效率也可以通過蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）進行評估。然而，該方法常產(chǎn)生來自非特異性抗體結(jié)合的假陽性條帶，從而導致誤判沒有干擾效果。因此，在使用時需要確?？贵w的特異性。

您使用的shRNA可能只打靶基因的某個轉(zhuǎn)錄本

在設計shRNA時，我們推薦您使用那些能靶向單個基因多個轉(zhuǎn)錄本的shRNA，除非您只想打靶特定轉(zhuǎn)錄本。VectorBuilder提供針對常見物種的shRNA數(shù)據(jù)庫。當您將shRNA元件插入載體時，您可以選擇shRNA數(shù)據(jù)庫，通過搜索目的基因查看所有可用的shRNA詳細信息。您還可以打開其中的UCSC鏈接，查看shRNA序列在基因組和轉(zhuǎn)錄本中位置等信息。