技術(shù)詳情
基因列表
我們的ORF集合包含超過(guò)16,000個(gè)基因，長(zhǎng)度范圍從100 bp到10,000 bp不等，涵蓋多種類型的經(jīng)典信號(hào)通路，比如細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖、免疫反應(yīng)、發(fā)育和分化等。點(diǎn)擊此處下載ORF文庫(kù)的全基因列表。
文庫(kù)設(shè)計(jì)
細(xì)致的文庫(kù)設(shè)計(jì)是取得篩選實(shí)驗(yàn)成功的基礎(chǔ)。以下是您在設(shè)計(jì)ORF文庫(kù)時(shí)需要考慮的關(guān)鍵因素：
- 基因遞送系統(tǒng)：用于ORF文庫(kù)的病毒和非病毒的基因遞送系統(tǒng)各有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和局限。在非病毒系統(tǒng)中，常規(guī)質(zhì)粒簡(jiǎn)單且成本效益高，適合瞬時(shí)表達(dá)。PiggyBac是一種非病毒的、基于轉(zhuǎn)座子原理的系統(tǒng)。該系統(tǒng)可將轉(zhuǎn)基因整合到基因組中，并具有很大的轉(zhuǎn)基因裝載容量。在病毒系統(tǒng)中，慢病毒載體允許轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定整合到基因組中，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期表達(dá)。AAV作為一種非整合型病毒類型的基因遞送系統(tǒng)，特別是對(duì)于體內(nèi)應(yīng)用具有高安全性且高遞送效率的特點(diǎn)，但其裝載容量較小。
- 啟動(dòng)子：取決于您的實(shí)驗(yàn)需求，您可能需要使用組成型、誘導(dǎo)型、或者組織特異性啟動(dòng)子。比如使用組織特異性啟動(dòng)子對(duì)于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通常是有幫助的。點(diǎn)擊此處了解關(guān)于啟動(dòng)子的更多信息。
- 藥篩標(biāo)記基因：在載體中包含抗生素抗性基因?qū)τ诤Y選成功轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞是必要的。如果您使用的是已經(jīng)帶有抗生素抗性的細(xì)胞系（例如，293T細(xì)胞對(duì)新霉素有抗性），請(qǐng)確保你的文庫(kù)選擇了不同的藥篩標(biāo)記基因。我們通常推薦使用嘌呤霉素抗性基因，因?yàn)樗梢詭?lái)快速有效的篩選效果。點(diǎn)擊此處了解關(guān)于藥篩標(biāo)記基因的更多信息。
- 蛋白標(biāo)簽：添加諸如His或者Flag的蛋白標(biāo)簽或者設(shè)計(jì)帶有GFP和mCherry的融合蛋白將有助于對(duì)ORF的表達(dá)檢測(cè)、純化以及定位。點(diǎn)擊此處查看云舟生物可提供的蛋白標(biāo)簽類型。
- 熒光/化學(xué)發(fā)光報(bào)告基因：在ORF表達(dá)載體上添加熒光或化學(xué)發(fā)光報(bào)告基因有助于對(duì)ORF表達(dá)的可視化并進(jìn)行細(xì)胞分選，從而實(shí)時(shí)追蹤細(xì)胞事件。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，這些報(bào)告基因可以直接與ORF相融合以原位標(biāo)記目的蛋白，也可以被不同的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)實(shí)現(xiàn)非原位的且獨(dú)立的表達(dá)效果監(jiān)測(cè)。關(guān)于報(bào)告基因的更多信息，請(qǐng)點(diǎn)擊此處了解。
- Barcode：在混合文庫(kù)的篩選實(shí)驗(yàn)中，使用細(xì)胞和分子barcode可對(duì)成千上萬(wàn)種ORF進(jìn)行經(jīng)濟(jì)且高效的分析。設(shè)計(jì)barcode在載體中的位置時(shí)需要策略性的考察，以確保測(cè)序結(jié)果的有效性以及與文庫(kù)克隆、篩選以及逆卷積過(guò)程的兼容性。
我們的文庫(kù)設(shè)計(jì)團(tuán)隊(duì)可根據(jù)您的需求定制ORF文庫(kù)。如果您需要了解更多相關(guān)信息，可點(diǎn)擊此處發(fā)送設(shè)計(jì)咨詢。
混合文庫(kù) vs. 陣列文庫(kù)
云舟生物的ORF文庫(kù)可以通過(guò)混合文庫(kù)或者陣列文庫(kù)的形式交付。這兩種形式均有各自的實(shí)驗(yàn)方法與優(yōu)勢(shì)。
| 特點(diǎn) | 混合文庫(kù) | 陣列文庫(kù) |
|---|
| 文庫(kù)構(gòu)建 | 攜帶barcode的所有ORF質(zhì)?；虿《净旌显谝黄?/td> | 多孔板內(nèi)每孔分別對(duì)應(yīng)一種帶有barcode的ORF質(zhì)?；虿《?/td> |
| 文庫(kù)篩選 | 高通量篩選 | 針對(duì)每個(gè)ORF的系統(tǒng)性研究 |
| 實(shí)驗(yàn)方法 | 參照組和實(shí)驗(yàn)組中均同時(shí)包含成千上萬(wàn)種ORF | 每孔獨(dú)立一個(gè)ORF |
| 優(yōu)勢(shì) | 對(duì)于大規(guī)模研究快速且高性價(jià)比，允許同時(shí)分析大量ORF | 對(duì)實(shí)驗(yàn)條件可以精確控制，減少交叉污染 |
| 不足之處 | 在沒(méi)有進(jìn)行額外的逆卷積和驗(yàn)證步驟時(shí)，識(shí)別表型所對(duì)應(yīng)的特定ORF具有挑戰(zhàn)性 | 因存在對(duì)ORF的個(gè)別處理和分析，需求更多的人力和成本 |
體外和體內(nèi)篩選
在體外和體內(nèi)系統(tǒng)中，云舟生物的專家團(tuán)隊(duì)都可以為您進(jìn)行ORF文庫(kù)篩選以識(shí)別富集的基因。體外篩選快速且技術(shù)簡(jiǎn)單明了，使用您選擇的細(xì)胞系即可快速識(shí)別差異表達(dá)的基因。但是需要注意的是，文庫(kù)在體外篩選的結(jié)果有時(shí)并不能完全代表體內(nèi)篩選的結(jié)果，這是因?yàn)獒槍?duì)體外條件優(yōu)化的載體可能在體內(nèi)不具備相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)效率。此外，對(duì)于在體外表現(xiàn)出特定表達(dá)模式的載體，其在體內(nèi)也可能會(huì)有不一樣的表現(xiàn)。
對(duì)于那些難以在體外培養(yǎng)又或包含在復(fù)雜組織結(jié)構(gòu)里的細(xì)胞類型，動(dòng)物模型可以作為一個(gè)更可靠的體內(nèi)ORF文庫(kù)篩選平臺(tái)。盡管小鼠和NHP均被用于體內(nèi)篩選，為保證載體在基因治療應(yīng)用中的高效性，與人類高度相似的NHP模型通常更受青睞。體內(nèi)篩選有多種給藥途徑可供選擇，包括尾靜脈注射、面靜脈注射（用于新生小鼠和大鼠）、腦室內(nèi)注射、視網(wǎng)膜下腔注射、玻璃體內(nèi)注射、鼓室內(nèi)注射和肌肉注射等。我們所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在獲得AAALAC認(rèn)證的設(shè)施中進(jìn)行。
將ORF文庫(kù)遞送至靶細(xì)胞或動(dòng)物后，通過(guò)測(cè)定報(bào)告基因或barcode的表達(dá)來(lái)評(píng)估候選ORF的活性?？梢赃M(jìn)行多輪篩選以確保對(duì)目標(biāo)的精準(zhǔn)識(shí)別。篩選后，提取細(xì)胞基因組DNA或總RNA，然后使用其測(cè)序和富集/耗竭的分析結(jié)果進(jìn)行逆卷積處理。
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