載體構(gòu)建

作為全球最大的定制載體服務(wù)商，云舟生物可以根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)需求量身定制您的DNA載體。我們擁有超過200種經(jīng)過優(yōu)化且適用于各種研究應(yīng)用的載體系統(tǒng)，均經(jīng)過體外試驗(yàn)以及體內(nèi)試驗(yàn)（若可行）驗(yàn)證。使用我們的平臺(tái)進(jìn)行載體定制和克隆將顯著降低傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室DIY載體的試劑、時(shí)間和人力成本，大幅提高研究者的載體構(gòu)建效率。

除了DNA載體的分子克隆外，我們還提供多種相關(guān)服務(wù)如質(zhì)粒DNA制備、病毒包裝、文庫構(gòu)建、細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建以及治療性IVT RNA合成等。

亮點(diǎn)

免費(fèi)、高度直觀的載體設(shè)計(jì)平臺(tái)，可幫助您使用我們經(jīng)過驗(yàn)證的海量的庫存載體骨架和載體元件快速定制您所需要的載體。

樂高式的載體元件組裝流程，可支持定制載體高效且可靠的平行克隆，超過95%的項(xiàng)目如期交付。

對(duì)于極富挑戰(zhàn)性的載體構(gòu)建項(xiàng)目富有經(jīng)驗(yàn)。

客戶擁有其定制載體的IP并享有6個(gè)月免費(fèi)載體存儲(chǔ)服務(wù)（超過6個(gè)月的載體收取一定基因調(diào)取費(fèi)用）。

服務(wù)詳情

載體構(gòu)建的一般流程

Overview and workflow of custom cloning services

*價(jià)格與基因調(diào)取、骨架、克隆方法相關(guān)。

價(jià)格與周期

超過>80%的載體元件可直接從我們的庫存（基于過去的生產(chǎn)數(shù)據(jù)）中調(diào)取，其余則可通過從頭合成、客戶提供的材料（載體骨架和模板）中獲得。我們的定制載體構(gòu)建流程包含了對(duì)客戶材料的QC（若有需要）、調(diào)取載體元件和載體骨架、實(shí)際的載體克隆工作、以及最后的放行前的載體QC。關(guān)于我們的定制載體構(gòu)建服務(wù)的價(jià)格和周期概覽下所示：

常規(guī)載體構(gòu)建服務(wù)

由云舟生物提供的標(biāo)準(zhǔn)化骨架和標(biāo)準(zhǔn)化元件進(jìn)行載體構(gòu)建。

常規(guī)載體的價(jià)格和周期如下：

服務(wù)類型	價(jià)格 (CNY)	周期*
shRNA載體構(gòu)建	￥1,080起	4-7 天
gRNA載體（單gRNA）構(gòu)建	￥1,080起	4-7 天
gRNA載體（雙gRNA）構(gòu)建	￥2,380起	6-12 天
表達(dá)載體構(gòu)建	￥880起	3-6 天

* 周期的定義：從接受訂單到發(fā)貨的時(shí)間，不包括客戶準(zhǔn)備材料所需要的時(shí)間（例如提供模板DNA）。腺病毒載體可能需要更長(zhǎng)時(shí)間。

復(fù)雜載體構(gòu)建服務(wù)

復(fù)雜載體是指使用VectorBuilder標(biāo)準(zhǔn)化骨架，但由更為復(fù)雜的需要構(gòu)建的元件組裝而成的載體。它們通常要經(jīng)過多個(gè)步驟來構(gòu)建，并且涉及復(fù)雜的操作過程，例如大片段的擴(kuò)增、多個(gè)片段融合、基因合成和靶向突變等。

復(fù)雜載體的額外價(jià)格和周期：

克隆步驟	額外價(jià)格 (CNY)	額外周期
插入一個(gè)PCR片段*	￥1,180起	9-18 天
插入多個(gè)融合PCR片段*	￥1,480起	10-26 天
基因需要從頭合成**	基因合成費(fèi) + 加工費(fèi)	14-28天
靶向突變	￥1,100/位點(diǎn)	7-9 天

對(duì)于克隆上面未列出的其他類型片段，例如高GC片段，簡(jiǎn)單重復(fù)或分段重復(fù)序列，可能需要額外的費(fèi)用和周期。

*對(duì)于7kb<ORF<10kb的，需要額外增加￥1,000 費(fèi)用和 10 天的周期。對(duì)于ORF需要添加promoter、tag或者在其兩端添加酶切位點(diǎn)的，額外費(fèi)用請(qǐng)咨詢。

**對(duì)于<10kb的ORF，合成費(fèi)用將根據(jù)合成的長(zhǎng)度定價(jià)在￥1/bp-￥1.5/bp之間。對(duì)于>10kb的ORF，基因從頭合成的價(jià)格與周期請(qǐng)咨詢。

如何訂購

技術(shù)詳情

質(zhì)量控制（QC）

我們保證所有交付的載體其實(shí)際序列與理論序列100%相符。. 下表展示了我們的載體QC項(xiàng)目。

載體構(gòu)建所用材料
	載體骨架	載體元件
云舟生物庫存	酶切分析全長(zhǎng)Sanger測(cè)序
客戶提供材料	酶切分析全長(zhǎng)Sanger測(cè)序（可選）	全長(zhǎng)Sanger測(cè)序
從頭合成	-	全長(zhǎng)Sanger測(cè)序
終載體
酶切分析全長(zhǎng)Sanger測(cè)序（取決于構(gòu)建方法） NGS（可選）

客戶提供材料

如果客戶選擇自行提供載體構(gòu)建的相關(guān)材料，我們將對(duì)其提供的載體骨架進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，并對(duì)關(guān)鍵區(qū)域進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。該類載體屬于非標(biāo)準(zhǔn)載體，載體價(jià)格因情況而定。如果需要提供骨架或模板，請(qǐng)按照外來物品接收指南將相應(yīng)材料郵寄給我們。

常見問題解答

云舟生物使用什么方法進(jìn)行載體構(gòu)建？▼

云舟生物可使用多種策略進(jìn)行載體克隆。在我們的高度優(yōu)化的克隆平臺(tái)上，一般的表達(dá)載體我們使用Gateway克隆和Gibson組裝等方式構(gòu)建，而shRNA和gRNA載體則使用基于直接連接的方式構(gòu)建，價(jià)格低且周期短。此外，根據(jù)具體項(xiàng)目的需要，我們也可以使用從頭基因合成、Golden Gate等方式構(gòu)建載體。

云舟生物構(gòu)建的載體的宿主菌是什么？客戶可以使用什么類型菌株擴(kuò)增質(zhì)粒載體？▼

云舟生物構(gòu)建的質(zhì)粒載體的宿主菌通常為VB UltraStable™，一種轉(zhuǎn)化效率高（>1x10⁹ cfu/ug）并可用于擴(kuò)增不穩(wěn)定重復(fù)序列的菌株。因此，我們也高度推薦您使用我們的VB UltraStable™化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞以用于您的載體擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。我們也提供其它宿主菌，如DH5α和Stbl3，可滿足多樣的實(shí)驗(yàn)需要。

為什么我提取的質(zhì)粒濃度很低？▼

質(zhì)粒上的復(fù)制起點(diǎn)屬于低拷貝型

質(zhì)粒的拷貝數(shù)是由質(zhì)粒上的復(fù)制起點(diǎn)決定的，有的復(fù)制起始點(diǎn)屬于低拷貝型。請(qǐng)確認(rèn)質(zhì)粒上復(fù)制起點(diǎn)類型。對(duì)于低拷貝質(zhì)粒，則需要擴(kuò)大細(xì)菌培養(yǎng)量以獲得足夠的質(zhì)粒DNA。

進(jìn)一步了解不同載體復(fù)制起點(diǎn)的拷貝數(shù)

用于質(zhì)粒提取的菌量過少

請(qǐng)檢查確認(rèn)質(zhì)粒制備柱的結(jié)合容量以及您的質(zhì)粒是高拷貝還是低拷貝質(zhì)粒。對(duì)于小量提取，我們建議您收集1-5 ml過夜培養(yǎng)菌液。對(duì)于大量提取，如果質(zhì)粒是高拷貝，我們推薦使用100-150 ml過夜培養(yǎng)菌液；如果是低拷貝，我們推薦使用300-500 ml過夜培養(yǎng)菌液。一般情況下，對(duì)于高拷貝質(zhì)粒，1 ml的過夜培養(yǎng)菌液可以小量提取約5 ug的質(zhì)粒DNA，150 ml的過夜培養(yǎng)菌液可以提取約500 ug的質(zhì)粒DNA；對(duì)于低拷貝質(zhì)粒（如pET），1 ml過夜培養(yǎng)菌液可以小量提取1.5-2.5 ug質(zhì)粒DNA，150 ml過夜培養(yǎng)菌液可以提取150-200 ug質(zhì)粒DNA。

只有小部分菌體含有質(zhì)粒

有的抗生素，尤其是氨芐青霉素，在液體培養(yǎng)中會(huì)快速降解，導(dǎo)致不含質(zhì)粒的細(xì)菌可以大量繁殖，最終使得質(zhì)粒制備產(chǎn)量低。為了避免這種情況，請(qǐng)?jiān)谑褂们靶迈r制備含氨芐青霉素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并確保提供足夠的濃度。另外，在培養(yǎng)具有氨芐抗性的細(xì)菌時(shí)，請(qǐng)不要讓菌液飽和培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)。因?yàn)殡S著培養(yǎng)時(shí)間的增加，培養(yǎng)基的抗生素會(huì)越來越少，許多細(xì)菌細(xì)胞也已死亡且它們所含的質(zhì)粒DNA會(huì)被降解，所以從過飽和培養(yǎng)的菌液中提取的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量會(huì)低。請(qǐng)從新鮮菌液提取質(zhì)粒DNA，如果不能立即進(jìn)行質(zhì)粒制備，則可以將菌體離心沉淀，并儲(chǔ)存于-80°C冰箱中備用。

直接取甘油菌進(jìn)行接菌培養(yǎng)

直接將接收到的甘油菌或穿刺菌進(jìn)行接種，可能會(huì)偶爾出現(xiàn)質(zhì)粒制備產(chǎn)量低的情況。我們建議先在含有適當(dāng)抗生素的LB平板上劃線，然后挑取單菌落接種到含有相應(yīng)抗生素的新鮮液體培養(yǎng)基中。具體操作說明請(qǐng)?jiān)诓藛螜?ldquo;資源中心>說明書/MSDS>甘油菌”進(jìn)行查看。

沒有正確使用質(zhì)粒提取試劑盒

請(qǐng)?jiān)谑褂们白屑?xì)閱讀質(zhì)粒制備試劑盒使用說明書，防止不當(dāng)操作。

質(zhì)粒制備柱質(zhì)量較差

某些品牌的質(zhì)粒DNA制備柱質(zhì)量較差，請(qǐng)及時(shí)檢測(cè)更換相應(yīng)試劑盒。

如果客戶提供的材料序列包含突變?cè)趺崔k？▼

當(dāng)我們對(duì)客戶材料進(jìn)行QC時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)序列有突變，我們會(huì)主動(dòng)聯(lián)系您以確認(rèn)是否仍然進(jìn)行載體構(gòu)建。如果突變屬于同義突變，則通常不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果突變屬于非同義突變，我們會(huì)與您溝通在載體構(gòu)建和下游實(shí)驗(yàn)前最佳的處理方案。

甘油菌使用說明

載體家構(gòu)建的質(zhì)粒載體一般以甘油菌形式交付。關(guān)于甘油菌的使用可參考以下視頻內(nèi)容：