云舟生物專有的miniVec^®質(zhì)粒是一種面向細(xì)胞和基因治療應(yīng)用的效力更顯著、安全性更高且適合于大規(guī)模生產(chǎn)的微環(huán)DNA載體。與傳統(tǒng)質(zhì)粒相比，miniVec^®質(zhì)粒可獲得更高的產(chǎn)量、更好的病毒包裝效率，有利于改善轉(zhuǎn)基因表達(dá)并且提高了安全性。miniVec^®的載體骨架的制備支持無(wú)抗生素（Antibiotic-free）、無(wú)培養(yǎng)基添加劑（Supplement-free）等生產(chǎn)要求。miniVec^® 質(zhì)粒可應(yīng)用于多種如慢病毒、腺相關(guān)病毒（AAV）、體外轉(zhuǎn)錄（IVT）、非病毒常規(guī)質(zhì)粒、piggyBac和睡美人（Sleeping Beauty）等轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)的載體設(shè)計(jì)。

miniVec^®技術(shù)詳情

圖1展示了miniVec^®系統(tǒng)的工作原理。作為系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，miniHost™是一種經(jīng)過(guò)基因改造的大腸桿菌菌株，包含一個(gè)生長(zhǎng)抑制基因。經(jīng)過(guò)miniVec^®質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，miniHost™細(xì)胞可以在常規(guī)LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，而無(wú)需使用抗生素篩選。從miniVec^®骨架轉(zhuǎn)錄獲得的VecSeqB可以通過(guò)RNA-RNA互補(bǔ)靶向生長(zhǎng)抑制基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的VecSeqA序列，從而阻止生長(zhǎng)抑制基因的翻譯。因此，只有成功轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞才能大量增殖，從而產(chǎn)生大量的miniVec^®質(zhì)粒。

這種無(wú)需抗生素的生產(chǎn)方案在增強(qiáng)安全性和制藥過(guò)程中具有顯著的優(yōu)勢(shì)。云舟生物的miniVec^®獨(dú)特技術(shù)進(jìn)一步保證了宿主菌細(xì)胞的存活性，在載體生產(chǎn)過(guò)程中消除了LB培養(yǎng)基中需要額外添加劑的需求。

圖1 miniVec^®骨架的轉(zhuǎn)化篩選機(jī)制

質(zhì)粒產(chǎn)量提升

與傳統(tǒng)質(zhì)粒相比，miniVec^®質(zhì)粒包含了多種特有機(jī)制，使其在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中有利于高拷貝數(shù)質(zhì)粒的擴(kuò)增，帶來(lái)了更高的復(fù)制效率且降低了細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān)，因此可獲得更高的質(zhì)粒產(chǎn)量。

圖2 與傳統(tǒng)質(zhì)粒相比，miniVec^®的質(zhì)粒產(chǎn)量增加。使用相同的條件將不同表達(dá)系統(tǒng)的傳統(tǒng)質(zhì)粒和miniVec^®質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌，以實(shí)驗(yàn)室規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，然后測(cè)量對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒產(chǎn)量。

轉(zhuǎn)基因表達(dá)量提升

與傳統(tǒng)的質(zhì)粒相比，miniVec^®質(zhì)粒經(jīng)過(guò)體外驗(yàn)證表明可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。這是因?yàn)槿コ思?xì)菌序列的微環(huán)DNA骨架進(jìn)一步降低了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的免疫反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)，減輕宿主細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，有利于提升細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)水平。

圖3 miniVec^®質(zhì)粒與傳統(tǒng)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率對(duì)比，miniVec^®的體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)更強(qiáng)。miniVec^®因此是用于開(kāi)發(fā)基因療法和DNA疫苗的理想載體。

圖4 小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，miniVec^®對(duì)比傳統(tǒng)質(zhì)粒的luciferase表達(dá)時(shí)間更長(zhǎng)。使用CAG>Luc2質(zhì)粒以相同的摩爾量注射小鼠:（A）靜脈注射、（B）肌肉注射。

高效的轉(zhuǎn)座子基因遞送

miniVec^®質(zhì)粒由于其簡(jiǎn)潔的序列、對(duì)宿主細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān)低以及高安全性等特點(diǎn)， 使其同時(shí)也是應(yīng)用于piggyBac和睡美人（Sleeping Beauty） 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的理想載體選擇。miniVec^®轉(zhuǎn)座子載體在細(xì)胞中表現(xiàn)出相當(dāng)高的轉(zhuǎn)座效率。

圖5 使用傳統(tǒng)質(zhì)粒和miniVec^®質(zhì)粒同時(shí)構(gòu)建piggyBac和Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座子載體，隨后轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)座效率。

更安全的病毒包裝原料

miniVec^®質(zhì)粒為重組病毒的GMP生產(chǎn)提供了一種相比傳統(tǒng)依賴抗生素的質(zhì)粒更安全的選擇。miniVec^®質(zhì)粒有助于降低終產(chǎn)物中潛在抗生素殘留的風(fēng)險(xiǎn)，并減少發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。這種特點(diǎn)提高了病毒GMP生產(chǎn)的安全性，在保證終產(chǎn)物純度的同時(shí)使其更容易滿足監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)的要求。此外，miniVec^®質(zhì)粒對(duì)比傳統(tǒng)質(zhì)?？蓭?lái)更高的病毒滴度。

圖6 使用傳統(tǒng)質(zhì)粒與miniVec^®質(zhì)粒包裝慢病毒的比較。（A）使用miniVec^®質(zhì)?？色@得更高的慢病毒滴度。功能性滴度通過(guò)qPCR法測(cè)量。（B）使用傳統(tǒng)質(zhì)粒與miniVec^®質(zhì)粒平行生產(chǎn)的慢病毒等體積轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞，比較EGFP的表達(dá)。