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AAV衣殼定向進(jìn)化

重組AAV病毒由于其多樣的組織嗜性、長(zhǎng)時(shí)間的轉(zhuǎn)基因表達(dá)效果、非致病性以及低免疫原性等特點(diǎn),作為一種基因遞送載體被廣泛用于基因治療和疫苗開(kāi)發(fā)。

既有的AAV血清型存在一定的問(wèn)題影響了其用于基因治療的潛力。首先,盡管現(xiàn)有的血清型提供了一系列組織嗜性以供選擇,但是在臨床應(yīng)用上仍然具有一些類型的組織是這些血清型的特異性無(wú)法覆蓋的。第二,盡管一些特定血清型的AAV可特異感染靶組織,但是其基因遞送效率可能偏低,或者具有脫靶效應(yīng)感染其他組織。第三,體內(nèi)預(yù)先存在針對(duì)多種AAV血清型的中和抗體將從一開(kāi)始或者多次給藥后阻礙AAV的感染。最后,一些AAV血清型類型相比其它類型更難在生產(chǎn)中獲得高的滴度、純度和穩(wěn)定性。為克服這些問(wèn)題,AAV衣殼開(kāi)發(fā)在加速獲得新型AAV突變體、改善AAV性能方面一直是相當(dāng)重要的技術(shù)。

定向進(jìn)化是一種常用于提高生物大分子性能的高通量方法。該方法模擬自然選擇過(guò)程并將其所耗時(shí)間大幅縮短。AAV衣殼定向進(jìn)化通過(guò)突變野生型AAV衣殼基因,獲得具備高度多樣性的AAV衣殼文庫(kù),然后從中篩選出全新的、性能更優(yōu)越的AAV衣殼。由于定向進(jìn)化不需要具備蛋白結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)的先驗(yàn)知識(shí),因此在新型AAV衣殼開(kāi)發(fā)上相對(duì)于理論設(shè)計(jì)方式更具優(yōu)勢(shì)。

如何獲取AAV衣殼定向進(jìn)化CRO服務(wù)?

關(guān)于CRO項(xiàng)目的服務(wù)咨詢請(qǐng)發(fā)郵件至service@vectorbuilder.cn。如果您有更多相關(guān)問(wèn)題,請(qǐng)點(diǎn)擊聯(lián)系我們。

服務(wù)亮點(diǎn)

  • 全方面的服務(wù)平臺(tái):載體家是當(dāng)前全球唯一一家具備AAV臨床前、臨床CRO和CDMO一站式服務(wù)的企業(yè)。我們的AAV相關(guān)服務(wù)涵蓋載體設(shè)計(jì)、載體優(yōu)化、載體克隆、文庫(kù)構(gòu)建、病毒包裝、衣殼定向進(jìn)化和工程改造、AAV組織分布鑒定、GMP病毒生產(chǎn)等。
  • 多策略定向進(jìn)化構(gòu)建衣殼高度多樣性的病毒文庫(kù):我們?cè)谖膸?kù)構(gòu)建方面的豐富經(jīng)驗(yàn),可以幫助您通過(guò)定向進(jìn)化以及其結(jié)合方法進(jìn)行自定義設(shè)計(jì),以獲得極具病毒衣殼多樣性的文庫(kù)。
  • 文庫(kù)病毒高滴度包裝:我們可使用一步法或兩步法包裝文庫(kù)病毒,并保證每種衣殼或基因組發(fā)生突變的病毒均具有很高的滴度。
  • 使用包括非人靈長(zhǎng)類(Non-human primate,NHP)在內(nèi)的多種模式生物進(jìn)行體內(nèi)篩選:除了進(jìn)行體外篩選,我們還提供一系列模式生物用于進(jìn)行體內(nèi)篩選,如小鼠、大鼠、以及重要的兩種非人靈長(zhǎng)類:食蟹猴(Macaca fascicularis)和獼猴(Macaca Mulatta)。所有體內(nèi)篩選試驗(yàn)均在經(jīng)過(guò)AAALAC認(rèn)證的機(jī)構(gòu)中以專業(yè)認(rèn)可的方式進(jìn)行。
  • 完善的技術(shù)支持:我們的科學(xué)家在AAV衣殼開(kāi)發(fā)項(xiàng)目上具有深厚的經(jīng)驗(yàn),能夠?yàn)槟峁┤娴募夹g(shù)支持,包括從文庫(kù)設(shè)計(jì)、文庫(kù)構(gòu)建到體內(nèi)篩選以及NGS分析。

衣殼進(jìn)化和篩選流程

實(shí)施AAV衣殼定向進(jìn)化的第一步也是最關(guān)鍵一步是制備高度多樣性的AAV轉(zhuǎn)移載體文庫(kù),每個(gè)載體上包含一個(gè)嵌合型AAV基因組:含有一個(gè)rep基因和一個(gè)突變cap基因?,F(xiàn)今已有多種方式可以高效制備這種突變cap基因,比如易錯(cuò)PCR(Error-prone PCR)、隨機(jī)多肽展示(Random peptide display)、家族DNA洗牌(DNA family shuffling)、以及計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)(In silico design)等。轉(zhuǎn)移載體被包裝成病毒顆粒,每個(gè)病毒顆粒的基因組包含一個(gè)突變cap基因。文庫(kù)中這些混雜的嵌合型病毒隨后被篩選并測(cè)試以下方面:一、高效轉(zhuǎn)導(dǎo)特定組織或器官的靶細(xì)胞;二、高度親和細(xì)胞特異性表面受體;三、能夠逃避中和抗體。經(jīng)過(guò)篩選后的的病毒基因組從靶細(xì)胞中復(fù)原,然后被用于構(gòu)建一個(gè)新的更小的文庫(kù)用于第二輪篩選,并在多個(gè)篩選周期后得到某種富集的突變型衣殼。該基因克隆經(jīng)過(guò)驗(yàn)證即認(rèn)為發(fā)現(xiàn)了一種新型的具有更強(qiáng)性能的變異AAV衣殼(圖1)。

圖1 AAV衣殼定向進(jìn)化的典型篩選流程

定向進(jìn)化構(gòu)建衣殼文庫(kù)

以下策略常用于制備突變型AAV衣殼。用于篩選的衣殼文庫(kù)通過(guò)大規(guī)模并行克隆AAV載體獲得。這些載體均包含了嵌合型的AAV基因組(每個(gè)載體包含一個(gè)rep基因和一個(gè)突變cap基因)。

易錯(cuò)PCR

易錯(cuò)PCR是最直接用于開(kāi)發(fā)高度多樣化的AAV衣殼的選擇,這其中包括從修改標(biāo)準(zhǔn)PCR方法到突變AAV衣殼基因等多種方式。更具體而言,易錯(cuò)PCR結(jié)合了多種次優(yōu)化的PCR條件,如使用低保真性聚合酶、更長(zhǎng)的延伸時(shí)間、更高的Mg2+濃度、添加Mn2+,以及使用不相等的多種dNTP濃度等方式來(lái)對(duì)AAV衣殼基因引入隨機(jī)突變。

隨機(jī)多肽展示

隨機(jī)多肽展示通常使用7到9個(gè)隨機(jī)多肽序列插入到AAV衣殼蛋白序列的特定位點(diǎn),以達(dá)到改變病毒與特定細(xì)胞表面受體的天然相互作用的目的。插入的多肽一般位于AAV衣殼暴露此段多肽的位置或者介導(dǎo)病毒與細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵位置。例如,AAV2衣殼蛋白的587位到588位氨基酸(位于VRIII可變區(qū))是一個(gè)適用于AAV2多肽展示文庫(kù)的插入位點(diǎn)。在此位點(diǎn)插入多肽可以阻礙與AAV2作用的硫酸類肝素多糖蛋白(Heparan sulfate proteoglycan, HSPG)模體的功能(HSPG是識(shí)別AAV2的主要細(xì)胞表面受體),并促進(jìn)展示的多肽與細(xì)胞表面分子相互作用。

家族DNA洗牌

家族DNA洗牌是一種通過(guò)不同AAV血清型的親本衣殼基因分子雜交產(chǎn)生嵌合AAV衣殼的高效方法。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn),將不同AAV血清型的親本衣殼基因碎片化,然后通過(guò)無(wú)引物PCR利用部分序列同源性將其重組為新型AAV衣殼。作為一種替代策略,還可以通過(guò)綜合洗牌法與其他設(shè)計(jì)方法創(chuàng)建高復(fù)雜性的文庫(kù),即將理論設(shè)計(jì)(基于AAV生物學(xué)的先驗(yàn)知識(shí)修改衣殼序列)與定向進(jìn)化相結(jié)合。在這種方法中,為發(fā)現(xiàn)和評(píng)估適合進(jìn)行突變的衣殼位點(diǎn),將首先對(duì)天然血清型的AAV衣殼的精細(xì)結(jié)構(gòu)和序列進(jìn)行分析。這些含有突變的基因碎片最后將合成為全長(zhǎng)序列,并用于組裝新型AAV衣殼。

計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)

現(xiàn)今已有多種計(jì)算機(jī)方法可用于預(yù)測(cè)促使AAV性能得到加強(qiáng)的衣殼序列。其中一個(gè)常用的方法是祖先衣殼重建,涉及多個(gè)計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)的祖先AAV衣殼文庫(kù)的構(gòu)建,然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以發(fā)現(xiàn)組織嗜性得到改進(jìn)的衣殼序列。該方法背后的機(jī)理在于經(jīng)自然選擇留下的AAV進(jìn)化中間體大概率上已演化出獨(dú)特的性狀,并且仍然能維持病毒的結(jié)構(gòu)和功能。另一方面,機(jī)器學(xué)習(xí)則是另一種廣泛使用的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)方法,根據(jù)輸入的大量蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系數(shù)據(jù)來(lái)預(yù)測(cè)新型AAV病毒衣殼的組裝。

衣殼文庫(kù)的病毒包裝

衣殼文庫(kù)的病毒包裝可以劃分為一步法或者兩步法,如下所述:

一步法包裝衣殼文庫(kù)

包裝AAV衣殼文庫(kù)的傳統(tǒng)方法是采用一步法:衣殼文庫(kù)和腺病毒輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞。雖然這種方法被廣泛使用,但它確實(shí)存在交叉包裝(具備衣殼變異體的AAV顆粒其基因組和衣殼類型不匹配)和衣殼鑲嵌(AAV的衣殼組分來(lái)源于多種變異體)的缺點(diǎn)。為了克服這些問(wèn)題,建議以極低的文庫(kù)質(zhì)粒數(shù)/細(xì)胞數(shù)比率轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞,以確保每個(gè)細(xì)胞至多吸收一個(gè)文庫(kù)質(zhì)粒。

兩步法包裝衣殼文庫(kù)

在兩步法包裝中,衣殼文庫(kù)首先與編碼野生型衣殼基因但缺少病毒ITR的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至包裝細(xì)胞中。這將產(chǎn)生帶有鑲嵌型衣殼的AAV顆粒,這種部分由野生型VP蛋白組成的衣殼被稱為AAV轉(zhuǎn)移穿梭機(jī)(AAV transfer shuttle)。將此種AAV以低感染復(fù)數(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞,以實(shí)現(xiàn)每個(gè)細(xì)胞至多感染一個(gè)病毒顆粒。隨后用野生型腺病毒對(duì)包裝細(xì)胞進(jìn)行雙重感染,最終產(chǎn)生高滴度病毒衣殼文庫(kù)。

體外與體內(nèi)文庫(kù)篩選

為獲得帶有期望性狀的嵌合型AAV,根據(jù)篩選目的病毒衣殼文庫(kù)通常需要經(jīng)過(guò)在體外或者體內(nèi)的多次篩選:

體外篩選

利用已建立的細(xì)胞系篩選AAV衣殼文庫(kù)是一種常用的體外篩選方法,特別是用于發(fā)現(xiàn)靶向受體能力發(fā)生變化的衣殼突變型AAV。AAV文庫(kù)的體外篩選快速且技術(shù)簡(jiǎn)單,但是也存在一定的問(wèn)題。首先,針對(duì)體外高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率優(yōu)化的載體在體內(nèi)使用時(shí)可能無(wú)法重現(xiàn)相同的效率。其次,在體外表現(xiàn)出對(duì)靶細(xì)胞高度特異性的AAV載體在體內(nèi)時(shí)可能會(huì)轉(zhuǎn)導(dǎo)非靶組織。體外篩選AAV文庫(kù)的另一種策略是在感染靶細(xì)胞之前,將AAV文庫(kù)加入免疫動(dòng)物的強(qiáng)效血清中以辨別具有免疫逃避屬性的突變型衣殼。然而,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)衣殼突變的AAV引發(fā)免疫反應(yīng)類型可能并不一致(即使同樣的AAV載體,通過(guò)不同途徑輸送也可能會(huì)產(chǎn)生不同的免疫反應(yīng))。

體內(nèi)篩選

體內(nèi)動(dòng)物模型為篩選AAV文庫(kù)提供了更可靠的平臺(tái),特別是用于尋找那些需要轉(zhuǎn)導(dǎo)體外難以培養(yǎng)的細(xì)胞的或者需要轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)雜組織結(jié)構(gòu)中的特定細(xì)胞的AAV突變體。體內(nèi)篩選還有助于發(fā)現(xiàn)與AAV突變體相關(guān)的任何的潛在脫靶效應(yīng)。小鼠和NHP均廣泛用于AAV文庫(kù)的體內(nèi)篩選,但是NHP模型由于與人類的高度相似,因此是篩選與臨床應(yīng)用相關(guān)的改良型AAV載體的最佳平臺(tái)。

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