常見(jiàn)問(wèn)題
藥物篩選標(biāo)記 熒光蛋白 基因組編輯 蛋白表達(dá) shRNA 病毒包裝 其他
熒光蛋白,螢光素酶和LacZ都是基于重組蛋白的報(bào)告基因,可以用于定位或成像研究。然而,這幾類蛋白各有不同,適用于不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
熒光蛋白和螢光素酶都屬于發(fā)光蛋白,可用照相機(jī)或類似的裝置來(lái)檢測(cè)熒光表達(dá)。熒光蛋白通過(guò)吸收一種顏色的光(激發(fā)),然后發(fā)出不同顏色(發(fā)射)的較低能量光來(lái)起作用。相反,螢光素酶(和其他生物發(fā)光酶)通過(guò)催化底物(即螢光素)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而發(fā)光。
熒光蛋白比螢光素酶明亮得多,這有利于將其應(yīng)用到許多不同類型的實(shí)驗(yàn)中。但是,在組織樣品或活體動(dòng)物中,背景、自發(fā)熒光和光散射等問(wèn)題可能會(huì)影響熒光的觀察。熒光素酶的活性分析需要螢光素,所以在分析之前必須將該底物加入培養(yǎng)基或注射到活體動(dòng)物體內(nèi)。與熒光蛋白相比,這可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性或定量。
與上述兩種標(biāo)記不同,LacZ不發(fā)光。相反,LacZ基因的產(chǎn)物β-半乳糖苷酶可以催化X-gal轉(zhuǎn)化成類似于靛藍(lán)的不透明藍(lán)色化合物。為了使LacZ可視化,首先必須將樣品用X-gal溶液染色,且該染色步驟與活體樣品觀察不兼容。盡管高度敏感,但LacZ/X-gal染色是非定量的,并且不能提供類似熒光或生物發(fā)光蛋白的高分辨率。
通常情況下,我們建議LacZ用于整體胚胎或組織切片的基因表達(dá)研究。對(duì)于活體動(dòng)物研究來(lái)說(shuō),熒光或生物發(fā)光可能是更好的選擇,但也跟多種因素有關(guān),如是否需要對(duì)內(nèi)部深層組織進(jìn)行成像以及是否存在標(biāo)記亮度問(wèn)題。