表達(dá)菌株不合適

表達(dá)載體在不適當(dāng)?shù)乃拗骶曛锌赡軣o法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。VectorBuilder大多數(shù)載體的克隆宿主菌株都是Stbl3（具體詳看載體報告）。Stb13能夠保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，是優(yōu)選的克隆宿主，但它可能不適用于重組蛋白表達(dá)。例如，對于pET載體，IPTG誘導(dǎo)的重組蛋白表達(dá)需要含有T7 RNA聚合酶的宿主菌株，而Stbl3卻沒有。因此，原核細(xì)菌表達(dá)載體通常需要將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到合適的宿主菌如BL21（DE3）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

載體上表達(dá)的蛋白“有問題”

有時候，當(dāng)表達(dá)的蛋白是非溶性的，或折疊錯誤，不當(dāng)切割或?qū)?xì)菌宿主有毒性時，目的蛋白往往不能正常誘導(dǎo)表達(dá)。在這種情況下，您需要優(yōu)化誘導(dǎo)條件（詳見下文），或者替換成更耐受的宿主菌株或更換表達(dá)載體類型。

誘導(dǎo)條件有待優(yōu)化

根據(jù)待表達(dá)基因，表達(dá)載體和宿主菌株等因素，您可能需要考慮優(yōu)化以下誘導(dǎo)條件：OD₆₀₀（通常為0.6-0.8）；誘導(dǎo)劑（如IPTG或L-阿拉伯糖）的濃度不能太低或太高；誘導(dǎo)持續(xù)時間不能太短或太長；誘導(dǎo)溫度，特別是在處理“有問題”蛋白時（見上文），可以測試不同的溫度梯度（如16°C，25°C，30°C，37°C等）。在極少數(shù)情況下，由于原因不明，相同表達(dá)載體的不同克隆可能會表現(xiàn)出不同的表達(dá)能力，因此您可能需要挑選多個單菌落進(jìn)行單獨測試，以篩選出具有最佳誘導(dǎo)效果的克隆。

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