低到中等程度的抗性基因表達(dá)就能讓細(xì)胞獲得對藥物的抗性。相反，熒光蛋白（FP）則需要高水平的表達(dá)才能獲得明亮的熒光信號，較低或者中等程度的熒光表達(dá)會(huì)產(chǎn)生較弱的熒光信號，甚至?xí)陀谠O(shè)備檢測的最低臨界值。此外，某些熒光蛋白（如EBFP）比常用熒光蛋白（如EGFP）更暗淡，特別難以檢測。一些研究人員不得不使用抗熒光蛋白抗體，以可視化體外細(xì)胞培養(yǎng)或體內(nèi)的熒光蛋白。以下是導(dǎo)致熒光不良的最常見原因：

弱啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光蛋白的表達(dá)

有一些啟動(dòng)子本身就比較弱（如UBC），只能驅(qū)動(dòng)熒光蛋白的弱表達(dá)。有的啟動(dòng)子（如CMV）可以在體外細(xì)胞培養(yǎng)中很好地起作用，但有時(shí)在體內(nèi)會(huì)沉默。當(dāng)表達(dá)熒光蛋白時(shí)，您應(yīng)該盡可能嘗試使用一個(gè)強(qiáng)的廣泛性啟動(dòng)子（如EF1A或CAG）。如果您必須使用組織特異性啟動(dòng)子，請盡可能選擇一個(gè)表達(dá)能力強(qiáng)的；如果您必須使用弱或很弱的啟動(dòng)子，請為熒光蛋白信號不足的可能性做好準(zhǔn)備。當(dāng)這種情況發(fā)生時(shí)，這并不意味著您的熒光蛋白沒有表達(dá)，它可能只是表達(dá)量不高。您可以使用更靈敏的檢測方法，如RT-PCR或免疫熒光進(jìn)行檢測。

了解更多啟動(dòng)子信息

在慢病毒和MMLV載體中表達(dá)熒光蛋白

對于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)（慢病毒或者M(jìn)MLV），聚腺苷酸化信號（poly A）不能存在于LTR之間，因?yàn)檫@會(huì)抑制病毒的包裝。多聚腺苷酸化信號存在于3'LTR中，來自上游啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄會(huì)經(jīng)過上游ORF的末尾繼續(xù)往下游的啟動(dòng)子和ORF轉(zhuǎn)錄，這會(huì)導(dǎo)致下游ORF的表達(dá)部分受到抑制。當(dāng)下游ORF為熒光蛋白時(shí)，其表達(dá)會(huì)大大減少。您可以采取如下措施提高熒光蛋白的表達(dá)：

• 使用不同的載體系統(tǒng)，比如使用常規(guī)載體，腺病毒載體或腺相關(guān)病毒載體

  了解更多載體系統(tǒng)信息

• 使用熒光更強(qiáng)的熒光蛋白變體（如TurboGFP代替EGFP）

  了解更多熒光蛋白信息

• 如果考慮在多順反子的上游表達(dá)盒表達(dá)熒光蛋白，您可以使用2A linker連接目的基因和熒光蛋白基因。然而，這可能會(huì)影響多順反子中其他ORF的生物學(xué)功能，也可能導(dǎo)致熒光蛋白表達(dá)較弱（見下文），且會(huì)增加載體構(gòu)建的成本和時(shí)間。

  了解更多連接子（linkers）信息

在多順反子中表達(dá)熒光蛋白

當(dāng)在多順反子中表達(dá)熒光蛋白基因時(shí)，通常會(huì)存在以下所述問題，且有時(shí)熒光蛋白基因的表達(dá)與上游下游ORF有關(guān)。

• 熒光蛋白基因在IRES的下游

  在包含一個(gè)或多個(gè)IRES元件的多順反子中，與上游ORF相比，下游ORF表達(dá)水平比較低（通常為上游的10%-20%）。如果一個(gè)熒光蛋白在IRES的下游表達(dá)，則熒光會(huì)較弱。如果您必須在多順反子的下游表達(dá)熒光蛋白，您可以考慮使用2A肽（如P2A或T2A），而不是IRES。通過使用2A肽，多順反子下游ORF通常與上游ORF的表達(dá)量相當(dāng)（或稍微低一點(diǎn)）。然而，2A肽也有缺陷，如可能會(huì)影響靶基因（GOI）的功能。當(dāng)存在多個(gè)2A肽時(shí)，下游ORF傾向于以較低水平表達(dá)。另外，2A肽的自我切割并不是100％有效的，其效率會(huì)受上下游ORF序列的影響。因此，不能進(jìn)行有效自我切割的融合蛋白將會(huì)是一種翻譯產(chǎn)物，在某些實(shí)驗(yàn)運(yùn)用中，這是一個(gè)值得注意的問題。需要特別注意的是2A肽的切割會(huì)在上游蛋白的C末端留下額外的短肽，并在下游蛋白的N末端留下額外的脯氨酸。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中，這種情況不會(huì)產(chǎn)生不良影響，但是在某些情況下可能會(huì)影響蛋白功能。

  了解更多IRES和2A肽（linkers）信息

• 熒光蛋白是融合蛋白的一部分

  融合蛋白幾乎總是表現(xiàn)出比未融合蛋白較弱的熒光（比如EGFP/Neo融合蛋白的熒光比單獨(dú)的EGFP熒光更弱）。此外，未經(jīng)測試的融合蛋白可能存在胞內(nèi)不穩(wěn)定，錯(cuò)誤折疊或無功能等問題。如果您懷疑這些是熒光弱的原因，可以嘗試以下操作：

• 使用更強(qiáng)的啟動(dòng)子（例如EF1A）來驅(qū)動(dòng)融合基因的表達(dá)

                      了解更多啟動(dòng)子信息

• 以非融合形式表達(dá)熒光蛋白

• 使用更亮的熒光蛋白變體（如TurboGFP代替EGFP）

                      了解更多熒光蛋白信息

• 增加一個(gè)linker，或者使用不同的linker來連接熒光蛋白和目的基因

                      了解更多連接子（linkers）信息

• 調(diào)換熒光蛋白和目的基因的位置

熒光蛋白本身亮度低

一些熒光蛋白本身比同一顏色家族的其它種類熒光更暗。例如在藍(lán)色家族中，EBFP的亮度僅為TagBFP亮度的三分之一。我們建議您根據(jù)我們的熒光報(bào)告基因指南選擇一個(gè)更亮的熒光蛋白變體。

了解更多熒光蛋白基因和對比信息