慢病毒載體（Lentivirus vectors）的特性：在非分裂和分裂細胞中穩(wěn)定整合、轉基因的長期表達、低免疫原性，使其成為基因治療的理想基因轉移載體。轉基因可以在非分裂或終末分化的非常靜止的細胞（例如神經(jīng)元）中實現(xiàn)。我們的慢病毒載體來源于HIV-1病毒，序列經(jīng)過精心優(yōu)化，提高了生物安全性、基因表達水平和病毒轉導效率。慢病毒顆粒通常是在包裝細胞中共表達病毒體包裝元件和載體基因組來產生的。我們開發(fā)出了一系列專有技術和試劑，從病毒滴度、純度、活性以及一致性等方面提升了慢病毒包裝工藝水平。除了科研級別的慢病毒外，我們還提供GMP級別的慢病毒制備服務。
| 生產規(guī)格 | 總量 | 最小滴度 | 分裝 | 價格（CNY） | 周期 |
| 慢病毒微量制備New | >107 TU | >108 TU/ml | 4x25 ul | ￥1,480.00 | 6-12天 |
| 慢病毒小量制備 | >2.5x107 TU | >108 TU/ml | 10x25 ul | ￥3,180.00 | |
| 慢病毒中量制備 | >108 TU | >108 TU/ml | 10x100 ul | ￥4,680.00 | |
| 慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥7,780.00 | |
| 超純化慢病毒中量制備 | >5x108 TU | >109 TU/ml | 10x50 ul | ￥9,780.00 | |
| 超純化慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥11,880.00 |
| 生產規(guī)格 | 總量 | 最小滴度 | 分裝 | 價格（CNY） | 周期 |
| 二代慢病毒微量制備New | >107 TU | >108 TU/ml | 4x25 ul | ￥1,480.00 | 6-12天 |
| 二代慢病毒小量制備 | >2.5x107 TU | >108 TU/ml | 10x25 ul | ￥3,180.00 | |
| 二代慢病毒中量制備 | >108 TU | >108 TU/ml | 10x100 ul | ￥4,680.00 | |
| 二代慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥7,780.00 | |
| 超純化二代慢病毒中量制備 | >5x108 TU | >109 TU/ml | 10x50 ul | ￥9,780.00 | |
| 超純化二代慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥11,880.00 |
| 生產規(guī)格 | 總量 | 最小滴度 | 分裝 | 價格（CNY） | 周期 |
|---|---|---|---|---|---|
| 非整合型慢病毒微量制備New | >107 TU | >108 TU/ml | 4x25 ul | ￥1,480.00 | 6-12天 |
| 非整合型慢病毒小量制備 | >2.5x107 TU | >108 TU/ml | 10x25 ul | ￥3,180.00 | |
| 非整合型慢病毒中量制備 | >108 TU | >108 TU/ml | 10x100 ul | ￥4,680.00 | |
| 非整合型慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥7,780.00 | |
| 超純化非整合型慢病毒中量制備 | >5x108 TU | >109 TU/ml | 10x50 ul | ￥9,780.00 | |
| 超純化非整合型慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥11,880.00 |
| 非純化慢病毒制備服務 | 純化慢病毒制備服務 | |
| 交付內容 | 定制病毒，按照規(guī)格交付：
| 定制病毒，按照規(guī)格交付：
|
對照病毒，按照定制病毒的規(guī)格對應贈送：
| 對照病毒，按照定制病毒的規(guī)格對應選購：
| |
| Polybrene（5 mg/ml，200 ul），贈送 | Polybrene（5 mg/ml，200 ul），贈送 | |
輔助病毒，按照定制病毒的規(guī)格對應選購：
| 輔助病毒，按照定制病毒的規(guī)格對應選購：
| |
| 病毒重懸液 | HBSS緩沖液 | HBSS緩沖液 |
| 運輸/存儲 | 干冰/-80°C，避免反復凍融 | 干冰/-80°C，避免反復凍融 |
| 推薦應用 | 體外培養(yǎng)細胞轉導 | 體外培養(yǎng)細胞轉導、動物體內細胞轉導 |
對照病毒
為了更好地開展您的實驗，我們按照“對照病毒與定制病毒的生物學應用相匹配”的原則給您贈送或者推薦對照病毒。例如，如果定制病毒表達一個基因，則推薦的對照病毒表達熒光蛋白EGFP。如果定制病毒表達打靶某個基因的shRNA，則對照病毒表達一個Scramble shRNA。推薦的對照病毒信息如下表所示：
| 對照病毒 | 對照載體名稱 | 對照載體ID | 定制病毒 |
| EGFP對照慢病毒，EGFP/mCherry雙熒光，Puro抗性 | pLV[Exp]-EGFP/Puro-EF1A>mCherry | VB010000-9492agg | 哺乳動物基因表達慢病毒（包含Tet-On誘導表達和FLEX條件性表達）、哺乳動物CRISPR慢病毒、哺乳動物非編碼RNA表達慢病毒 |
| Scramble shRNA對照慢病毒，EGFP熒光，Puro抗性 | pLV[shRNA]-EGFP/Puro-U6>Scramble_shRNA | VB010000-9526zpu | 哺乳動物shRNA干擾慢病毒 |
| Scramble miR30-shRNA對照慢病毒，EGFP/mCherry雙熒光，Puro抗性 | pLV[miR30]-EGFP/Puro-EF1A>mCherry:Scramble_miR30-shRNA | VB010000-9489dta | 哺乳動物miR30-shRNA干擾慢病毒 |
| TRE-mCherry對照慢病毒，EGFP/mCherry雙熒光，Puro抗性（選購） | pLV[TetOn]-EGFP/Puro-TRE>mCherry | VB010000-9514bbz | 哺乳動物基因Tet-On誘導表達TRE慢病毒 |
| FLEX-mCherry對照慢病毒，EGFP/mCherry雙熒光，Puro抗性（選購） | pLV[FLEXon]-EGFP/Puro-EF1A>LL:rev(mCherry):rev(LL) | VB010000-9498wee | 哺乳動物基因FLEX條件性表達慢病毒 |
輔助病毒
為了更好地開展您的實驗，我們按照“輔助病毒與定制病毒的生物學應用相匹配”的原則給您推薦輔助病毒。例如，如果定制病毒是一個只含TRE啟動子的TetOn慢病毒，則需要一個表達rtTA的輔助病毒，才能進行誘導表達實驗。推薦的輔助病毒信息如下表所示：
| 輔助病毒 | 輔助載體名稱 | 輔助載體ID | 定制病毒 |
| Cas9慢病毒，Hygro抗性（選購） | pLV[Exp]-CBh>hCas9/Hygro | VB010000-9509hde | 哺乳動物gRNA慢病毒（不含Cas9） |
MS2/P65/HSF1慢病毒（dCas9-SAM系統(tǒng)元件之一），Hygro抗性（選購） 注意：該ORF序列存在特殊結構，使用其生產的慢病毒的滴度有可能會比同規(guī)格慢病毒的保證滴度低1-10倍。 | pLV[Exp]-EF1A>MS2/P65/HSF1/Hygro | VB010000-9513dyx | 哺乳動物msgRNA表達慢病毒（dCas9-SAM系統(tǒng)元件之一） |
| dCas9/VP64慢病毒（dCas9-SAM系統(tǒng)元件之一），Bsd抗性（選購） | pLV[Exp]-EF1A>dCas9/VP64/Bsd | VB010000-9512pbs | 哺乳動物msgRNA表達慢病毒（dCas9-SAM系統(tǒng)元件之一） |
| Cre慢病毒，Hygro抗性（選購） | pLV[Exp]-CMV>Cre/Hygro | VB010000-9501ebu | 哺乳動物基因FLEX條件性表達慢病毒 |
| tTS/rtTA慢病毒，Hygro抗性（選購） | pLV[Exp]-CMV>tTS/rtTA/Hygro | VB010000-9508gcc | 哺乳動物基因Tet-On誘導表達TRE慢病毒 |
我們的慢病毒存儲在HBSS緩沖液中，并采用干冰運輸。收到慢病毒后，立即放置于-80℃，長期貯存至少6個月。慢病毒的保質期約為一年。請避免反復凍融，因為這會導致慢病毒滴度大幅下降。
| 步驟 | 描述 | 時間 |
Co-transfection | 我們常規(guī)使用的第三代慢病毒包裝系統(tǒng)包括1個轉移質粒（Transfer plasmid）、1個膜蛋白表達質粒（Envelope plasmid）、2個包裝質粒（Packaging plasmids），將這些質粒共轉染包裝細胞。2個包裝質粒分別為Gag/Pol表達質粒和Rev表達質粒。 | 第1天 |
Supernatant collection | 在細胞里，轉移質粒轉錄出攜帶目的基因（Gene of Interest，簡稱GOI）的HIV RNA基因組，與包裝質粒表達出的衣殼結構蛋白、酶、調控蛋白組裝成病毒顆粒后，轉運到細胞膜內側，形成包膜病毒分泌到胞外。膜蛋白質粒表達的VSV-G膜蛋白錨定在細胞膜上，隨著病毒成熟，與細胞膜一起成為了病毒的膜。細胞短暫孵育后，收集上清，離心去除細胞碎片并過濾。 | 第3天 |
Concentration and purification | PEG濃縮病毒顆粒。對于超純化慢病毒（體內應用級別），采用蔗糖離心方法進一步純化、濃縮病毒。 | 第4天 |
Quality Control | 對病毒進行滴度測定（Titer determination）、微生物檢測（Bioburden test，針對細菌、真菌）、支原體檢測（Mycoplasma test）等。 若轉移載體同時編碼一個熒光蛋白，我們還會將病毒進行細胞轉導以測定相應的熒光表達情況（Transduction test）。此外，對于超純化慢病毒，我們還可以檢測內毒素水平（Endotoxin test）。 | 第5天及以后 |
注意：第三代慢病毒包裝系統(tǒng)只能包裝第三代的慢病毒轉移載體。但是第二代慢病毒包裝系統(tǒng)既能包裝第二代，也能包裝第三代的慢病毒轉移載體。第三代慢病毒轉移載體上的5’ LTR中的U3元件是被一個外源啟動子替代（如CMV啟動子或者RSV啟動子），使其不依賴Tat蛋白進行HIV RNA基因組的轉錄，故第三代慢病毒包裝系統(tǒng)的包裝質粒不含Tat蛋白。第二代慢病毒轉移載體上的5’ LTR是野生型的LTR，含有U3、R和U5元件，依賴Tat蛋白轉錄HIV RNA基因組，故第二代慢病毒包裝系統(tǒng)的包裝質粒含有Tat蛋白。
我們的滴度保證僅適用于這樣的轉移載體
對于如下這樣的轉移載體，我們不能保證滴度：
交付周期是指訂單接收到發(fā)貨之間的時間，不包括需要客戶提供任何物料（如病毒載體）的等待時間。對于不含有熒光標記，但是含有藥篩標記的病毒載體，如果您需要獲得細胞藥篩效果的質檢結果，由于細胞生長狀態(tài)需要較長時間觀察，周期將額外增加8-10天。
如需客戶提供慢病毒載體，則請按照外來物品接收指南將載體寄送給我們。請嚴格按照我們的指南來進行裝運以免造成物品的任何延誤和損壞。客戶提供的所有材料均需經(jīng)過QC檢測，每一份材料附加檢測費用。請注意，客戶提供物品接收并通過QC之后生產才正式開始。
慢病毒轉導
使用說明書
慢病毒體外應用慢病毒載體系統(tǒng)經(jīng)歷了至少三代演變發(fā)展，隨著代次更新，生物安全性逐步提高。第一代系統(tǒng)（1st generation）雖然使用了三質粒系統(tǒng)，但是仍保留了大部分HIV基因組，安全性欠佳，現(xiàn)已基本淘汰。相比第一代系統(tǒng)，第二代系統(tǒng)（2nd generation）剔除了與病毒復制相關的Vif、Vpr、Nef等輔助基因，僅保留了與病毒轉錄、組裝相關的Gag、Pol、Tat和Rev基因。值得注意的是，第二代系統(tǒng)的轉移載體是使用野生型 5‘ LTR啟動子轉錄HIV RNA轉錄本的。野生型 5‘ LTR啟動子依賴Tat蛋白的結合才能激活其轉錄活性，所以第二代慢病毒的包裝必須使用第二代系統(tǒng)的包裝質粒，因為它能表達Tat蛋白。
第三代系統(tǒng)（3rd generation）在第二代基礎上做了這些改進：
1. 包裝質粒被拆分成兩個，分別表達Rev和Gal/Pol，進一步降低了包裝質粒和轉移載體在包裝過程中產生DNA重組的幾率，從而降低形成復制型病毒的風險；
2. 包裝質粒上Tat基因被去除，進一步降低致癌的風險（Nunnari G 2008)。而轉移載體上的野生型5’ LTR元件改造成Hybrid 5' LTR，刪除了U3區(qū)域，并融合了強啟動子，如CMV或者RSV啟動子，可以不依賴Tat轉錄HIV RNA；
3. 3’ LTR的U3區(qū)域被刪除，不能將完整的3‘ LTR復制到5' LTR上，原病毒DNA就不能自我轉錄生成新的病毒RNA，具有這個特征的病毒被稱為自我失活型（Self inactivation，簡稱SIN）。第三代系統(tǒng)需要轉染四個質粒（1個轉移載體、2個包裝質粒、1個包膜蛋白表達質粒），對生產技術要求更高一些。第二代慢病毒包裝質?？梢园b第二、第三代的轉移載體，而第三代慢病毒包裝質粒系統(tǒng)缺少Tat，不能包裝第二代轉移載體。
| 慢病毒 | MMLV | 腺病毒 | AAV | |
| 組織嗜性 | 廣泛 | 廣泛 | hAd5只感染表達CAR受體的細胞 | 取決于血清型 |
| 是否可感染非分裂細胞 | 是 | 否 | 是 | 是 |
| 病毒基因組穩(wěn)定整合抑或游離于宿主基因組 | 穩(wěn)定整合 | 穩(wěn)定整合 | 游離的DNA附加體形式 | 游離的DNA附加體形式 |
| 自定義啟動子 | 是 | 否 | 是 | 是 |
| 應用 | 細胞培養(yǎng)和體內實驗 | 細胞培養(yǎng)和體內實驗 | 體內實驗 | 體內實驗 |
| 體內免疫反應 | 低 | 低 | 高 | 非常低 |
我們使用p24 ELISA法測定慢病毒滴度。該方法的三明治免疫試驗可測定HIV-1 核心蛋白p24在慢病毒上清液中的含量水平。我們首先在微量滴定板上加入慢病毒樣本，然后每孔加入HIV-1 p24捕獲抗體進行孵育，并隨后添加生物素化的p24二抗以結合p24一抗。此后，樣本中加入的辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素可特異性結合生物素化的p24二抗。在最后一步中，加入辣根過氧化物酶底物反應液，經(jīng)HRP催化產生有顏色的產物。每個孔的顏色深度最終反映了慢病毒樣本中的p24含量。使用分光光度計測量的樣本吸光度數(shù)值與重組HIV-1的 p24標準曲線進行對照，然后被換算為對應的慢病毒滴度。
野生型慢病毒HIV-1的基因組長度約為9.2 kb，這也是重組慢病毒載體的承載限度范圍。載體上能包裝進病毒的區(qū)域長度為從5’ LTR的R元件的第一個堿基到3’ LTR的R元件的最后一個堿基。超出承載量的片段插入則會造成病毒包裝滴度降低。
服務商工作站 >>
