CRISPR-Cas9可以通過多種方法遞送，包括質(zhì)粒、重組病毒、gRNA-Cas9 RNP復(fù)合物，以及gRNA和Cas9 IVT mRNA的混合物，而這些方法都有各自的優(yōu)勢和局限性。研究人員應(yīng)選擇適合自己實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的遞送方法，旨在通過最小化脫靶效應(yīng)和不良效果獲得最佳的編輯效率，而IVT RNA正迅速成為其中一種效果良好的基因編輯工具。

質(zhì)粒的大量制備一般成本較低，并且可以通過技術(shù)相對簡單的化學(xué)轉(zhuǎn)染和電穿孔進(jìn)行遞送。然而，由于這些遞送方式的自身特性，使得質(zhì)粒載體主要限于體外應(yīng)用。此外，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效率在不同細(xì)胞類型之間差異很大，且轉(zhuǎn)基因表達(dá)依賴于特定細(xì)胞類型的啟動(dòng)子活性，而這在某些系統(tǒng)中可能會(huì)降低轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率。因此，質(zhì)粒系統(tǒng)傾向配合使用高活性的啟動(dòng)子以確保Cas9的高水平表達(dá)，但是這也會(huì)增加脫靶效應(yīng)和質(zhì)粒DNA隨機(jī)整合到宿主基因組中的風(fēng)險(xiǎn)。

重組病毒是遞送CRISPR-Cas9的另一種常用工具，特別適合難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型，并且可以創(chuàng)建穩(wěn)定表達(dá)Cas9的細(xì)胞系以用于需要導(dǎo)入多個(gè)gRNA的實(shí)驗(yàn)。然而，該系統(tǒng)同樣與質(zhì)粒遞送系統(tǒng)一樣存在諸多相同的限制，包括依賴特定細(xì)胞類型的啟動(dòng)子，以及由于長期表達(dá)Cas9而導(dǎo)致的脫靶效應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)增加。此外，重組病毒也會(huì)帶來較高的插入突變風(fēng)險(xiǎn)，特別是在逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒系統(tǒng)中的Cas9基因整合細(xì)胞基因組的時(shí)候。

通過gRNA-Cas9 RNP復(fù)合物遞送可以繞過質(zhì)粒和重組病毒系統(tǒng)的許多限制，同時(shí)實(shí)現(xiàn)快速編輯，因?yàn)椴恍枰M(jìn)行轉(zhuǎn)錄或翻譯。然而，由于需要使用電穿孔方式實(shí)現(xiàn)高效的遞送，這種方法同樣主要限于體外應(yīng)用。通過這種方法進(jìn)行的基因編輯發(fā)生得很快，但隨著Cas9在宿主細(xì)胞中被降解，編輯效果會(huì)迅速減弱，因此常受到可用的Cas9蛋白的類型限制。

與上述方法相比，使用gRNA和Cas9 IVT mRNA的混合物進(jìn)行遞送當(dāng)前已被認(rèn)為同樣是一種高效的基因編輯方法，具有最小化脫靶效應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)。該方法中，gRNA和Cas9 IVT mRNA一起被封裝在脂質(zhì)納米顆?；蚧瘜W(xué)轉(zhuǎn)染試劑中，使得該系統(tǒng)適用于體外和體內(nèi)應(yīng)用，并且無需擔(dān)心存在整合宿主基因組的風(fēng)險(xiǎn)。此外，由于不需要進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)不依賴于特定的細(xì)胞類型啟動(dòng)子活性，翻譯的發(fā)生也相對更快，從而實(shí)現(xiàn)快速且高效的基因編輯。與gRNA-Cas9 RNP復(fù)合物相比，mRNA形式的Cas9基因具有更長的表達(dá)時(shí)長，可達(dá)成充分的基因編輯效果。然而，mRNA最終也會(huì)被降解，編輯僅暫時(shí)發(fā)生過，從而限制了脫靶效應(yīng)的影響。

總而言之，通過質(zhì)粒、重組病毒和gRNA-Cas9 RNP復(fù)合物遞送CRISPR-Cas9組分的方法均存在較多限制，對它們在許多場景中的應(yīng)用造成了阻礙。這些方法具有明顯的缺點(diǎn)，包括相對有限的編輯效率、較高的脫靶效應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)以及插入突變的潛在風(fēng)險(xiǎn)等。相對地，基于gRNA和Cas9 IVT mRNA混合物的遞送方式具有諸多優(yōu)點(diǎn)和較少的限制，是一種高效的基因編輯方法，應(yīng)更多地被考慮用于基因編輯實(shí)驗(yàn)。