下表為定制化慢病毒產(chǎn)品的交付內(nèi)容?？稍谙鄳?yīng)的COA（Certificate of analysis document）文件查看病毒滴度。

慢病毒產(chǎn)品使用干冰冷藏運輸。收到慢病毒后，可直接放置-80冷凍保存至少6個月，也可放置-20冷凍保存一周。將Polybrene放置-20冷凍保存，也可放置4保存兩周。

使用前，將病毒液放置冰上融解。實驗過程中，亦需保持冰上放置。慢病毒在高溫條件下失活較快。

若實際使用量較少，可將融解的慢病毒小量分裝多管，再放置-80冷凍保存。但需要注意的是，每一次凍融都會導(dǎo)致滴度下降（約20%）。

注意：應(yīng)避免反復(fù)凍融，以免造成滴度大幅降低。

所有VectorBuilder的慢病毒載體均是自我失活型，這意味著被感染的細胞不能復(fù)制出新的病毒顆粒，這是由于病毒中的基因組缺失了病毒復(fù)制相關(guān)基因?qū)е碌?。盡管如此，慢病毒本身具有轉(zhuǎn)導(dǎo)人原代細胞的能力，理論上仍存在生物危險的風(fēng)險。我們建議按照BSL-2規(guī)范（Biosafety Level-2，二級生物安全防護水平）對慢病毒進行操作。所有的操作、儲存以及生物廢料的處理均需依照公共發(fā)布的和所處機構(gòu)制定的規(guī)范條例。

建議使用表達綠色熒光蛋白的對照慢病毒來選出靶細胞的最佳感染復(fù)數(shù)（MOI，multiplicity of infection）。MOI，即每個細胞感染的病毒顆粒數(shù)。換言之，MOI=1即是指每個細胞的使用病毒量為1個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位（TU，transducing unit）。

貼壁細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗方法

1. 轉(zhuǎn)導(dǎo)前1天（第0天）

• 將一定數(shù)量的靶細胞接種至一個新的培養(yǎng)皿中（轉(zhuǎn)導(dǎo)時靶細胞的融合度應(yīng)為30%-50%）。放置于37、5% CO₂的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-20小時。例如，當靶細胞為293T時，建議在6孔板中的接種量為3×10⁵個/孔。

2. 轉(zhuǎn)導(dǎo)當天（第1天）

• 在冰上融解凍結(jié)的病毒液。偶爾情況下，融解后的病毒液會呈現(xiàn)輕微渾濁，這是正?，F(xiàn)象，不會影響正常使用。為了吸取到準確的病毒數(shù)量，請先輕柔吹打，混勻融解后的病毒顆粒，再取適量的病毒液至適量的培養(yǎng)基中，然后輕柔混勻（避免渦旋震蕩）。為獲得較好的轉(zhuǎn)導(dǎo)效果，培養(yǎng)基用量盡可能少，以覆蓋培養(yǎng)面表面為宜。一般而言，用量為100 μl/cm²。例如，使用6孔板進行轉(zhuǎn)導(dǎo)，建議培養(yǎng)基用量為1 ml/孔（6孔板每孔的表面積約為10 cm²）。

  注意：對于容易感染的細胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的初始MOI可在1-10。對于較難感染的細胞，可能需要更高的MOI。

• 盡管對于大部分細胞，Polybrene不是必需的，但對于某些細胞，Polybrene能提高慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。Polybrene是多聚陽離子，能通過中和電荷間的相互作用來增強假病毒衣殼和細胞膜的結(jié)合。但Polybrene對于某些細胞有毒性。如果使用Polybrene，應(yīng)選幾個工作濃度（1-10 μg/ml）測試Polybrene對靶細胞的毒性。一般情況下，5 μg/ml的Polybrene適合較多細胞。

  注意：過度暴露于Polybrene（大于12小時）會造成某些細胞中毒。

• 吸出原有培養(yǎng)基，然后向細胞中加入含有病毒的培養(yǎng)基。
• 輕柔地搖動培養(yǎng)板以使病毒液都能覆蓋每一處細胞，然后放置于37、5% CO₂ 的二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

  注意：如果您擔(dān)心細胞暴露在病毒液中太久可能會影響細胞狀態(tài)，可以將轉(zhuǎn)導(dǎo)時間縮短在6-8小時。

3. 第2天

• 換液。吸出含有病毒的培養(yǎng)基，加入新鮮的完全培養(yǎng)基，放置于37、5% CO₂ 的二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

4. 第3天及之后

• 慢病毒載體攜帶的基因通常在轉(zhuǎn)導(dǎo)第2天才開始表達。為了讓基因產(chǎn)物在細胞中持續(xù)積累，或者出現(xiàn)細胞表型的變化，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細胞。
• 抗性篩選：若慢病毒載體攜帶抗性基因，則可用抗生素來富集有效轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞。若轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高，可不進行抗性篩選。若采用抗生素篩選，則應(yīng)在第2天或者第3天向培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的抗生素。下表列出了4種常用抗生素對某些細胞的藥篩濃度以及時間。但對于某些特殊細胞，建議預(yù)先進行藥篩濃度的確認測試實驗。為了獲得較好的藥篩結(jié)果，尤其是針對敏感型細胞，必須使用不同濃度的抗生素來測試野生型細胞，制作致死曲線，再選用一個合適的抗生素濃度（盡可能地篩除掉未有效轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞，但又不會影響有效轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞，過高濃度的抗生素即使對攜帶抗性基因的細胞也會造成一定的傷害）?？股匾话阒辉谵D(zhuǎn)導(dǎo)后藥篩階段使用，一旦未有效轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞被殺死，存活的細胞就含有了整合進細胞基因組的慢病毒載體?？剐院Y選實驗還需要設(shè)置一孔不加病毒的細胞作為陰性對照，用來判斷藥篩結(jié)束的時間點。當對照細胞全部死亡時，藥篩應(yīng)結(jié)束。然而，少數(shù)情況下，在后期培養(yǎng)中，病毒載體攜帶的抗性基因可能會出現(xiàn)沉默現(xiàn)象。因此，需要延長藥篩時間以進一步殺死基因沉默的細胞。
• 熒光蛋白基因表達：新陳代謝能力較強的細胞，如293T和BHK21，被感染24小時后即可表達熒光基因。但是，對于代謝慢的細胞，如原代細胞、NSC，MSC等，則需要更多的時間來表達熒光基因，因此感染72-96小時后才能觀察到熒光。

*G418應(yīng)用于Neomycin抗性基因篩選。
** 傳代細胞可加快Blasticidin篩選。

貼壁細胞成功轉(zhuǎn)導(dǎo)實例

圖1. 按照本文實驗方法，使用表達綠色熒光蛋白的慢病毒以MOI=10轉(zhuǎn)導(dǎo)293T細胞。100×參數(shù)下拍照。
左圖：明視野；右圖：綠色熒光。

懸浮細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗方法

細胞可通過直接向其中添加病毒來進行轉(zhuǎn)導(dǎo)，或者使用一種離心感染的方法來轉(zhuǎn)導(dǎo)，該法能將慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率增加5-10倍。通過一種未知的機制，將病毒“離心”到細胞之上極大了增加了病毒與細胞接觸的可能性，從而增加轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。通過離心進行的轉(zhuǎn)導(dǎo)可在24孔板或者小體積中進行。不建議使用6孔板或者更大的體積進行離心，因為在離心過程中細胞也許不能完全被培養(yǎng)基覆蓋。在24孔板中操作：

• 在1 ml完全培養(yǎng)基中，接種5×10⁵個細胞/孔；
• 向培養(yǎng)基加入含有或者不含Polybrene的病毒。來回搖晃數(shù)次混勻。
• 密封培養(yǎng)板并放入酶標板轉(zhuǎn)子中。
• 室溫下（32）1000 g離心1小時。
• 離心結(jié)束后，吸出含有病毒的培養(yǎng)基并加入1 ml新鮮的完全生長培養(yǎng)基。
• 上下吸打，重懸細胞。
  注意：細胞傾向于黏附在培養(yǎng)板的邊緣。
• 在37孵育箱中復(fù)蘇細胞至少6小時（或者過夜）。
• 將細胞轉(zhuǎn)移到6孔板中。

懸浮細胞成功轉(zhuǎn)導(dǎo)實例

圖2. 按照本文的實驗方法，使用表達綠色熒光蛋白的慢病毒以MOI=10轉(zhuǎn)導(dǎo)Ba/F3細胞。100×參數(shù)下拍照。
左圖：明視野；右圖：綠色熒光。