下表是定制化水皰性口炎病毒假型糖蛋白莫洛尼鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒（MMLV逆轉(zhuǎn)錄病毒）的交付內(nèi)容?？稍谙鄳?yīng)COA（Cerificate of analysis document）文件查看病毒滴度。

1. MMLV病毒產(chǎn)品使用干冰冷藏運(yùn)輸。收到病毒后，可直接放置-80°C冷凍保存至少6個(gè)月，也可放置-20°C冷凍保存一周。將Polybrene放置-20°C冷凍保存，也可放置4°C保存兩周。

2. 使用前，將病毒液放置冰上進(jìn)行融解。實(shí)驗(yàn)過程中，亦需保持冰上放置。MMLV逆轉(zhuǎn)錄病毒在高溫條件下失活較快。

3. 若實(shí)際用量較少，可將融解的MMLV逆轉(zhuǎn)錄病毒小量分裝多管，再放置-80°C冷凍保存。但需要注意的是，每一次凍融都會(huì)導(dǎo)致病毒滴度下降（約20%）。
注意：應(yīng)避免反復(fù)凍融，以免造成滴度大幅降低。

所有Vectorbuilder的MMLV逆轉(zhuǎn)錄病毒都是無(wú)法復(fù)制的，這意味著被感染的細(xì)胞不能復(fù)制出新的病毒。這是由于病毒中的基因組缺失了病毒復(fù)制相關(guān)基因?qū)е碌?。盡管如此，由于VSVG-假病毒能轉(zhuǎn)導(dǎo)人類細(xì)胞，理論上仍有生物危險(xiǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。我們建議按照BSL-2規(guī)范（Biosafety Level-2，二級(jí)生物安全防護(hù)水平）對(duì)MMLV逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行操作。所有的操作、儲(chǔ)存以及生物廢料的處理均需依照公共發(fā)布的和所處機(jī)構(gòu)制定的規(guī)范條例。

我們建議使用表達(dá)綠色熒光蛋白的對(duì)照MMLV逆轉(zhuǎn)錄病毒來(lái)選出靶細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)（MOI，multiplicity of infection）。MOI，即每個(gè)細(xì)胞感染的病毒顆粒數(shù)。換言之，MOI=1即是指每個(gè)細(xì)胞的使用病毒量為1個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)單位（TU，transducing unit）。

貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)方法

1. 轉(zhuǎn)導(dǎo)前1天（第0天）

• 將一定數(shù)量的靶細(xì)胞接種至一個(gè)新的培養(yǎng)皿中（轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)靶細(xì)胞的融合度應(yīng)為30%-50%）。 放置于37°C、5% CO₂ 的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-20小時(shí)。例如，當(dāng)靶細(xì)胞為293T時(shí)，建議在6孔板中的接種量為3×10⁵個(gè)/孔。

2. 轉(zhuǎn)導(dǎo)當(dāng)天（ 第 1 天）

• 在冰上融解凍結(jié)的病毒液。偶爾情況下，融解后的病毒液會(huì)呈現(xiàn)輕微渾濁，這是正?，F(xiàn)象，不會(huì)影響正常使用。為了吸取到準(zhǔn)確的數(shù)量的病毒數(shù)量，請(qǐng)先輕柔吹打，混勻融解后的病毒顆粒，再取適量的病毒液至適量的培養(yǎng)基中，然后輕柔混勻（避免渦旋震蕩）。為獲得較好的轉(zhuǎn)導(dǎo)效果，培養(yǎng)基用量盡可能少，以覆蓋培養(yǎng)面表面為宜。一般而言，用量為100 μl/cm²。例如，使用6孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，建議培養(yǎng)基用量為1 ml/孔（6孔板每孔的表面積約為10 cm²）。
  注意：對(duì)于容易感染的細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的初始MOI可在1-10。對(duì)于較難感染的細(xì)胞，可能需要更高的MOI。

• 盡管對(duì)于大部分細(xì)胞，Polybrene不是必需的，但對(duì)于某些細(xì)胞，Polybrene能提高M(jìn)MLV逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。Polybrene是多聚陽(yáng)離子，能通過中和電荷間的相互作用來(lái)增強(qiáng)假病毒衣殼和細(xì)胞膜的結(jié)合。但Polybrene對(duì)某些細(xì)胞有毒性。如果使用Polybrene，則應(yīng)選幾個(gè)工作濃度（1-10 μg/ml）測(cè)試Polybrene對(duì)靶細(xì)胞的毒性。一般情況下，5 μg/ml的Polybrene適合較多細(xì)胞。
  注意：過度暴露于Polybrene（大于12小時(shí)）會(huì)造成某些細(xì)胞中毒。

• 吸出原有培養(yǎng)基，然后向細(xì)胞中加入含有病毒的培養(yǎng)基。

• 輕柔地?fù)u動(dòng)培養(yǎng)板以使病毒液都能覆蓋每一處細(xì)胞，然后放置于37°C、5% CO₂ 的二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。
  注意：如果您擔(dān)心細(xì)胞暴露在病毒液中太久可能會(huì)影響細(xì)胞狀態(tài)，可以將轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間縮短在6-8小時(shí)。

3. 第2天

• 換液。吸出含有病毒的培養(yǎng)基，加入新的完全培養(yǎng)基。37°C、5% CO₂ 的二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

4. 第3天及之后

• MMLV逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶的基因通常在轉(zhuǎn)導(dǎo)第2天才開始表達(dá)。為了讓基因產(chǎn)物在細(xì)胞中持續(xù)積累，或者出現(xiàn)細(xì)胞表型的變化，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細(xì)胞。

• 抗性篩選：若MMLV逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶抗性基因，則可用抗生素來(lái)富集有效轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。若轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高，可不進(jìn)行抗性篩選。若采用抗生素篩選，則應(yīng)在第2天或者第3天向培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的抗生素。下表列出了4種常用抗生素對(duì)某些細(xì)胞的藥篩濃度以及時(shí)間。但對(duì)于某些特殊細(xì)胞，建議預(yù)先進(jìn)行藥篩濃度的確認(rèn)測(cè)試實(shí)驗(yàn)。為了獲得較好的藥篩結(jié)果，尤其是針對(duì)敏感型細(xì)胞，必須使用不同濃度的抗生素來(lái)測(cè)試野生型細(xì)胞，制作致死曲線，再選用一個(gè)合適的抗生素濃度（用盡可能地篩除掉未有效轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，但又不會(huì)影響有效轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，過高濃度的抗生素即使對(duì)攜帶抗性基因的細(xì)胞也會(huì)造成一定的傷害）?？股匾话阒辉谵D(zhuǎn)導(dǎo)后藥篩階段使用，一旦未有效轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞被殺死，存活的細(xì)胞就含有了整合進(jìn)細(xì)胞基因組的MMLV逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。抗性篩選實(shí)驗(yàn)還需要設(shè)置一孔不加病毒的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，用來(lái)判斷藥篩結(jié)束的時(shí)間點(diǎn)。當(dāng)對(duì)照細(xì)胞全部死亡時(shí)，藥篩應(yīng)結(jié)束。然而，少數(shù)情況下，在后期培養(yǎng)中，病毒載體攜帶的抗性基因可能會(huì)出現(xiàn)沉默現(xiàn)象。因此，需要延長(zhǎng)藥篩時(shí)間以進(jìn)一步殺死基因沉默的細(xì)胞。

• 熒光蛋白基因表達(dá)：新陳代謝能力較強(qiáng)的細(xì)胞，如293T和BHK21，被感染24小時(shí)后即可表達(dá)熒光基因。但是，對(duì)于代謝慢的細(xì)胞，如原代細(xì)胞NSC，MSC等，則需要更多的時(shí)間來(lái)表達(dá)熒光基因，因此感染72-96小時(shí)后才能觀察到熒光。

推薦使用的抗生素濃度和藥篩時(shí)間

* G418應(yīng)用于Neomycin抗性基因篩選。

** 傳代細(xì)胞可加快Blasticidin篩選。

貼壁細(xì)胞成功轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)例

圖1所示為成功轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個(gè)實(shí)例。