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腺病毒體外應(yīng)用
交付內(nèi)容
下表為定制化腺病毒產(chǎn)品的交付內(nèi)容?？稍谙鄳?yīng)COA（Certificate of analysis document）文件中查看病毒滴度。
| 產(chǎn)品類型 | 交付內(nèi)容 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 應(yīng)用范圍 |
|---|---|---|---|
| 小規(guī)格包裝 | 定制病毒 | 濃縮病毒（>1010 PFU/ml, 10×25 µl, HBSS 保存液） | 體外培養(yǎng)細胞 |
| 對照病毒 | 濃縮病毒（>1010 PFU/ml, 1×100 µl, HBSS 保存液） | 體外培養(yǎng)細胞 | |
| 中規(guī)格包裝 | 定制病毒 | 濃縮病毒（>1010 PFU/ml, 10×100 µl, HBSS 保存液） | 體外培養(yǎng)細胞 |
| 對照病毒 | 濃縮病毒（>1010 PFU/ml, 2×100 µl, HBSS 保存液） | 體外培養(yǎng)細胞 | |
| 大規(guī)格包裝 | 定制病毒 | 濃縮病毒（>1011 PFU/ml, 10×100 µl, HBSS 保存液） | 體外培養(yǎng)細胞 |
| 對照病毒 | 濃縮病毒（>1010 PFU/ml, 2×100 µl, HBSS 保存液） | 體外培養(yǎng)細胞 | |
| 大規(guī)格包裝和超純化 | 定制病毒 | 超純化病毒（>1012 PFU/ml, 10×100 µl, GTS保存液） | 動物體內(nèi) |
| 對照病毒 | 超純化病毒（>1012 PFU/ml, 10×100 µl, GTS 保存液）（選購） | 動物體內(nèi) |
*表格所示產(chǎn)品規(guī)格適用范圍為一般腺病毒載體。
接收病毒后的處理
1.腺病毒產(chǎn)品使用干冰冷藏運輸。收到病毒后，可直接放置-80℃冷凍保存至少1年，也可放置-20℃條件冷凍保存2-3周。
2.使用前，將病毒液放置冰上進行融解。實驗過程中，亦需保持冰上放置。解凍后的腺病毒在4℃下保存1-2周不會造成其生物活性顯著降低。
3.若實際用量較少，可將融解的腺病毒少量分裝多管，再放置-80℃冷凍保存。
4.根據(jù)您的實驗用量，可將解凍后的腺病毒少量分裝后再次凍存。如果您需要對腺病毒進行稀釋，則需要用到PBS，注意現(xiàn)稀釋現(xiàn)用。
注意：盡管反復幾次凍融腺病毒不會造成其活性顯著降低，但請盡量避免這樣做。
安全須知
所有VectorBuilder的腺病毒載體均缺乏E1A，E1B和E3基因。E1A和E1B是產(chǎn)生活病毒所必需的，已通過生物工程的方法導入包裝細胞的基因組中。因此，由此類載體產(chǎn)生的腺病毒由于存在復制的缺陷性而具有重要的安全特性，這也就意味著被感染的細胞不能復制出新的病毒顆粒。盡管如此，腺病毒本身具有轉(zhuǎn)導人原代細胞的能力，理論上仍有生物危險的風險。腺病毒作為常見的人類病原體，可引發(fā)呼吸道炎癥、角膜損傷和角膜結(jié)膜損傷等。我們建議按照BSL-2規(guī)范（Biosafety Level-2，二級生物安全防護水平）對腺病毒進行操作。所有的操作、儲存以及生物肥料的處理均需依照公共機構(gòu)發(fā)布的和所處機構(gòu)制定的規(guī)范條例。 我們強烈建議使用者勿生產(chǎn)活的腺病毒，以免致癌。
靶細胞轉(zhuǎn)導
哺乳動物細胞轉(zhuǎn)導實驗方法
1. 轉(zhuǎn)導前1天（第0天）
- 將一定數(shù)量靶細胞接種至一個新的培養(yǎng)皿中（轉(zhuǎn)導時靶細胞的融合度應(yīng)為30%-50%）。放置37℃、5%CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-20個小時。例如，當靶細胞為293T時，建議接種3×105個細胞至6孔板的一個孔中。
2. 轉(zhuǎn)導當天（第1天）
- 在冰上融解凍結(jié)的病毒液。偶爾情況下，融解后的病毒液會呈現(xiàn)輕微渾濁狀態(tài)，這是正?，F(xiàn)象，不會影響正常使用。為了吸取到準確數(shù)量的病毒，請先輕柔吸打，混勻融解后的病毒顆粒，再取適量的病毒液至適量的培養(yǎng)基中，然后輕柔混勻（避免渦旋震蕩）。為獲得較好的轉(zhuǎn)導效果，培養(yǎng)基用量盡可能少，以覆蓋培養(yǎng)皿表面為宜。一般來說，用量約100 µl/cm2。例如，當在6孔板中進行轉(zhuǎn)導時，建議1個孔使用1 mL培養(yǎng)基（6孔板一個孔的表面面積約10 cm2）。
注意：對于不難感染的細胞，轉(zhuǎn)導細胞的初始MOI可在1-10之間。對于較難感染的細胞，可能需要更高的MOI。
- 吸出原有培養(yǎng)基，然后向細胞中加入含有病毒的培養(yǎng)基。
- 輕柔地搖動培養(yǎng)板以使病毒液都能覆蓋每一處細胞。放置于37℃、5%CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
注意：如果您擔心細胞暴露在病毒液中太久可能會影響細胞狀態(tài)，可以將轉(zhuǎn)到時間縮短在6-8小時。
3. 第2天
- 換液，吸出含有病毒的培養(yǎng)基，加入新鮮的完全培養(yǎng)基，放置于37℃、5%CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
4. 第3天及之后
- 轉(zhuǎn)導后，需要在理想的時間點分析目的基因的表達情況。一般而言，轉(zhuǎn)導后24-48時，目的基因明顯表達。
注意：在分裂活躍的細胞中（如倍增時間約為24小時），轉(zhuǎn)導后24小時內(nèi)即可檢測轉(zhuǎn)基因的表達；在轉(zhuǎn)導后第48-96小時（第2-4天）表達量達到最大；轉(zhuǎn)導5天后，表達水平通常會開始下降。對于分裂周期較長或者無分裂行為的細胞系而言，高水平的轉(zhuǎn)基因表達則通常會持續(xù)更長時間。如果您是第一次用構(gòu)建好的腺病毒轉(zhuǎn)導您的哺乳動物細胞，我們建議進行時間摸索實驗，以確定目的基因的最佳表達時間。
成功轉(zhuǎn)導實例
圖1所示為成功轉(zhuǎn)導的一個實例。
圖1. 按照本文實驗方案，使用表達綠色熒光蛋白的腺病毒以MOI=50轉(zhuǎn)導293T細胞。100×參數(shù)下拍照。 左圖：明視野；右圖：綠色熒光。
