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肝臟研究專用 AAV
肝臟是人體中參與許多物質(zhì)代謝和排毒的主要器官。多種代謝紊亂是肝起源的。由單一基因突變引起的遺傳性和獲得性代謝疾病多達(dá)幾百種，對于其中許多而言，原位肝移植是唯一已知的治療方法?？紤]到許多這些疾病的單基因性質(zhì)，基因治療方 法似乎自然適用于治療[1]基因治療能夠?qū)⒒虻恼？截惙湃爰?xì)胞，從而改變細(xì)胞的工作方式，達(dá)到治愈目的。為了將基 因插入細(xì)胞，基因療法使用載體將基因放入細(xì)胞。
AAV 病毒載體是極具應(yīng)用前景的基因給藥工具。野生 AAV 被認(rèn)為是非致病性的，感染個(gè)體后產(chǎn)生的免疫應(yīng)答水平極低，無法 自行復(fù)制，需依賴于與腺病毒或皰疹病毒的共同感染才能復(fù)制。
重組 AAV 載體自身只需攜帶一個(gè)順式元件，ITR，就能生產(chǎn)出重組 AAV 顆粒。由于缺乏 Rep 基因，重組 AAV 病毒基因組不整合宿主基因組，以染色體外形式長期存在，在非分裂細(xì)胞（如默認(rèn)狀態(tài)下的肝細(xì)胞）中也能實(shí)現(xiàn)治療性蛋白的持久表達(dá)，安全性極高[2]。另外，多種血清型AAV對肝細(xì)胞具有良好嗜性
載體家長期致力于高質(zhì)量的 AAV 載體構(gòu)建、AAV 病毒包裝，旨在讓您的研究更高效。
ssAAV vs. scAAV
與傳統(tǒng)的單鏈（single-stranded，ss）基因組 AAV 載體相比，自我互補(bǔ)（self-complementary，sc）AAV 載體具有更高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和更快的轉(zhuǎn)導(dǎo)動力學(xué)。ssAAV 載體通過宿主介導(dǎo)的 DNA 合成方式轉(zhuǎn)化為活性的雙鏈 DNA 形式。因此，雙鏈 DNA 的生成是 ssAAV 載體轉(zhuǎn)導(dǎo)中的限制步驟。由于基因組只能使用一半，scAAV 適合作為小基因的載體 [3] 。載體家提供 ssAAV、scAAV 兩種 AAV 載體構(gòu)建以及病毒包裝服務(wù)。
肝臟嗜性AAV血清型
載體家可提供多達(dá) 18 種 AAV 血清型：1-9、6.2、rh10、DJ、DJ/8、PHP.eB、PHP.S、AAV2-retro、AAV2-QuadYF、AAV2.7m8。
不同的血清型具有相似的結(jié)構(gòu)和大小。然而，由于衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)不同，它們具有不同的嗜性。AAV2 首先被報(bào)道在小鼠體內(nèi)實(shí)施靜脈注射后具肝嗜性。隨后，9 種常用的 AAV 血清型載體（AAV1-9、rh10）在小鼠體內(nèi)被證實(shí)具有肝嗜性，其中 AAV8 轉(zhuǎn)導(dǎo)效率非常高。后來臨床試驗(yàn)證實(shí) rAAV2 和 rAAV8 轉(zhuǎn)導(dǎo)人肝細(xì)胞無效。AAV3 雖然在小鼠體內(nèi)不具有肝嗜性，但被報(bào)道可以有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞和原代人肝細(xì)胞，和體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)非人靈長類動物的肝細(xì)胞 [3] 。我們對 AAV9進(jìn)行了肝臟轉(zhuǎn)導(dǎo)測試，效果如圖：
載體家測試 AAV9-CAG-EGFP 轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠肝臟效果。取 6 周齡小鼠，尾靜脈注射，注射劑量約 6 x 1011 vg/g。10 天后處死取材，制備冰凍切片，激光共聚焦顯微鏡觀察。
肝臟特異性啟動子
載體家不僅提供廣泛表達(dá)啟動子，如 CMV、EF1A、EFS、CAG、CBh 等，還可以提供多種肝臟特異性啟動子，幫助您高效 構(gòu)建肝臟特異表達(dá)的 AAV 載體。
| 啟動子名稱 | 描述 | 組織噬性 | 細(xì)胞噬性 |
|---|---|---|---|
| Afp | Mouse α-fetoprotein enhancer II fused with human beta globin promoter | Liver | Hepatocytes |
| Alb | Mouse albumin promoter | Liver | Mature hepatocytes |
| TBG | Human thyroxine-binding globulin promoter | Liver | Hepatocytes |
病毒遞送方法
向肝臟遞送 AAV 病毒載體可以分為肝臟直接遞送（Direct liver delivery）和外周載體遞送（Peripheral vector delivery）兩大類。早期動物研究使用的 AAV2 受制于血清型感染效率問題，理想的轉(zhuǎn)導(dǎo)方式是肝臟直接注射。后續(xù)發(fā)現(xiàn) AAV8、AAV9 等肝臟噬性更強(qiáng)的血清型后，從外周注射也能滿足高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的要求。在人的 AAV 基因治療臨床試驗(yàn)中，一 般從手臂靜脈注射病毒載體。不同遞送方式的對比如下表[4，5]。
| 方法 | 優(yōu)點(diǎn) | 不足 | 應(yīng)用物種 | |
|---|---|---|---|---|
| 肝臟直接遞送 | 肝葉注射Liver lobes injection | 轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高 | 高侵入性、操作復(fù)雜、有凝血缺陷的動物具有術(shù)后并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn) | Mouse |
| 肝門靜脈注射Portal vein injection（PV） | Rat、Dog、NHP | |||
| 脾被膜注射Splenic capsule injection | Mouse | |||
| 肝動脈注射Hepatic artery injection（HA） | NHP | |||
| 外周載體遞送 | 腹腔注射Intraperitoneal injection（IP） | 侵入性小、 易操作 | 應(yīng)用于中大型動物時(shí)被稀釋 | Mouse |
| 血管內(nèi)注射Intravenous injection（IV） | 注射體積較IP更為受限 | Mouse、Dog、NHP、Human |
肝臟結(jié)構(gòu)
肝臟從整體結(jié)構(gòu)上來看主要是由肝葉構(gòu)成的，包含左肝葉（Left lobe）和右肝葉（Right lobe）。每個(gè)肝葉由 8 個(gè)區(qū)塊組成，每個(gè)區(qū)塊包含 1000 個(gè)肝小葉（Hepatic lobule）。肝小葉是實(shí)現(xiàn)肝臟功能的基本結(jié)構(gòu)單位，為柱狀多面體，主要由肝細(xì)胞組成的肝板（Hepatic plate）、中央靜脈（Central vein）、肝血竇（Sinusoid）以及毛細(xì)膽管（Bile canaliculus）等微小結(jié)構(gòu)組成。肝臟功能眾多，可以產(chǎn)生膽汁、代謝脂肪、糖原貯存和血液過濾等，是重要的代謝器官。由于肝臟的重要性，當(dāng)肝臟缺損時(shí)，肝細(xì)胞可以再次分裂增殖，肝臟是唯一可以自我再生的內(nèi)部器官[6]。
肝臟具有雙重的血液供給：一方面通過肝門靜脈（Portal vein）匯集來自脾靜脈（Splenic vein）和腸系膜上靜脈（Superior mesenteric vein）等經(jīng)過多個(gè)消化器官的含營養(yǎng)物質(zhì)的血液，另一方面通過肝動脈（Hepatic artery）接受來自心臟的含氧血液。肝門靜脈和肝動脈進(jìn)入肝臟后即輻射出大量的門靜脈分支和肝動脈分支。血液從這些分支的血管進(jìn)入肝小葉，混合并流經(jīng)肝血竇，然后進(jìn)入肝小葉中心的中央靜脈，最后隨肝靜脈排出肝臟[6, 7]。
肝血竇實(shí)質(zhì)是一種特化的毛細(xì)血管。血竇壁與一般毛細(xì)血管壁不同，血竇壁內(nèi)皮細(xì)胞排列疏松，且細(xì)胞上具有窗孔（Fenestrae），細(xì)胞外無連續(xù)的基膜（Basement membrane）覆蓋。這些結(jié)構(gòu)導(dǎo)致大分子可以隨血漿穿過血竇壁進(jìn)入血竇和肝細(xì)胞之間的空隙?竇周隙（Space of Disse），而同時(shí)紅細(xì)胞和血小板被阻隔。肝細(xì)胞表面的微絨毛結(jié)構(gòu)也伸入竇周隙中，竇周隙因此是肝細(xì)胞和血漿進(jìn)行物質(zhì)交換的場所[8]。
鑒于以上的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，肝臟非常有利于使用系統(tǒng)性注射的方式進(jìn)行 AAV 轉(zhuǎn)導(dǎo)。首先體內(nèi)大量的血液經(jīng)門靜脈和肝動脈 進(jìn)入肝臟：一個(gè)成年人的肝臟每分鐘可通過約 1 L 的血流量，占全身用血比例的 10-15%。此外血竇壁的高通透性也允 許病毒顆粒經(jīng)血漿直接接觸肝細(xì)胞，有利于獲得高的感染效率[9]。
References
[1] Moscoso CG, Steer CJ. The Evolution of Gene Therapy in the Treatment of Metabolic Liver Diseases. Genes (Basel). 2020 Aug 10;11(8):915.
[2] Chamberlain K, Riyad JM, Weber T. Cardiac gene therapy with adeno-associaed virus-based vectors. Curr Opin Cardiol. 2017 May;32(3):275-282.
[3] Berns KI, Srivastava A. Next Generation ofAdeno-Associated Virus Vectors for Gene Therapy for Human Liver Diseases. Gastroenterol Clin North Am. 2019 Jun;48(2):319-330.
[4] Moscoso CG, Steer CJ. The Evolution of Gene Therapy in the Treatment of Metabolic Liver Diseases. Genes (Basel). 2020 Aug 10;11(8):915.
[5] Palaschak B, Herzog RW, Markusic DM. AAV-Mediated Gene Delivery to the Liver: Overview of Current Technolo- gies and Methods. Methods Mol Biol. 2019;1950:333-360.
[6] Venous Drainage of the Abdomen. teachmeanatomy.info/abdomen/vasculature/venous-drainage/.
[7]“The Liver: Structure, Function, and Disease.”Medical News Today, MediLexicon International, www.medical- newstoday.com/articles/305075#regeneration.
[8] Paxton, Steve, et al.“The Leeds Histology Guide.”Home: The Histology Guide, 1 Jan. 1970, www.histolo-gy.leeds.ac.uk/digestive/liver_hepatocyte.php.
[9] Kattenhorn LM, Tipper CH, Stoica L, Geraghty DS, Wright TL, Clark KR, Wadsworth SC. Adeno-Associated Virus Gene Therapy for Liver Disease. Hum Gene Ther. 2016 Dec;27(12):947-961.
