服務(wù)商工作站 >>
肌肉研究專(zhuān)用 AAV
肌肉是生物體內(nèi)可自身收縮產(chǎn)生力并促使運(yùn)動(dòng)發(fā)生的組織。肌肉病變通常表現(xiàn)為肌肉萎縮、肌收縮力減弱以至消失。肌肉疾病的產(chǎn)生有先天和后天等因素，對(duì)于先天遺傳缺陷的肌肉疾病，如杜興氏肌肉營(yíng)養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy， DMD），傳統(tǒng)藥物只能減緩肌肉退化，但是醫(yī)學(xué)界長(zhǎng)期缺乏有效的治愈手段?；蛑委熗ㄟ^(guò)向肌肉直接導(dǎo)入有助肌肉功能恢復(fù)的基因拷貝，是一種具有相當(dāng)吸引力的治療策略。實(shí)際上，當(dāng)前已有眾多臨床研究在探索肌肉疾病的基因治療效果[1]。
AAV病毒載體是極具應(yīng)用前景的基因給藥工具。野生AAV被認(rèn)為是非致病性的，感染個(gè)體后產(chǎn)生的免疫應(yīng)答水平極低，無(wú)法自行復(fù)制，需依賴(lài)于與腺病毒或皰疹病毒的共同感染才能復(fù)制。 重組AAV載體自身只需攜帶一個(gè)順式元件，ITR，就能生產(chǎn)出重組 AAV 顆粒。由于缺乏Rep基因，重組 AAV 病毒基因組不整 合宿主基因組，以染色體外形式長(zhǎng)期存在，在非分裂細(xì)胞（如肌細(xì)胞）中也能實(shí)現(xiàn)治療性蛋白的持久表達(dá)，安全性極高[2]。另外，多種血清型 AAV 對(duì)肌細(xì)胞具有良好嗜性。
載體家長(zhǎng)期致力于高質(zhì)量的 AAV 載體構(gòu)建、AAV 病毒包裝，旨在讓您的研究更高效。
ssAAV vs. scAAV
與傳統(tǒng)的單鏈（single-stranded，ss）基因組 AAV 載體相比，自我互補(bǔ)（self-complementary，sc）AAV 載體具有更高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和更快的轉(zhuǎn)導(dǎo)動(dòng)力學(xué)。ssAAV 載體通過(guò)宿主介導(dǎo)的 DNA 合成方式轉(zhuǎn)化為活性的雙鏈 DNA 形式。因此，雙鏈 DNA 的 生成是 ssAAV 載體轉(zhuǎn)導(dǎo)中的限制步驟。由于基因組只能使用一半，scAAV 適合作為小基因的載體[3]。載體家提供 ssAAV、scAAV 兩種 AAV 載體構(gòu)建以及病毒包裝服務(wù)。
肌肉嗜性AAV血清型
載體家可提供多達(dá) 18 種 AAV 血清型：1-9、6.2、rh10、DJ、DJ/8、PHP.eB、PHP.S、AAV2-retro、AAV2-QuadYF、 AAV2.7m8。
不同的血清型具有相似的結(jié)構(gòu)和大小。然而，由于衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)不同，它們具有不同的嗜性。AAV 載體的某些血清型， 例如 AAV1、2、6、7、8、9，可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞。直接肌肉注射 AAV 載體能產(chǎn)生局部高水平且持久的基因表達(dá)。此外，還可以通過(guò)靜脈內(nèi)遞送一些 AAV 血清型，例如 AAV6、8 和 9，來(lái)實(shí)現(xiàn)全身肌肉細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)[4, 5]。我們對(duì)小鼠骨骼肌進(jìn) 行了 AAV1 和 AAV9 的轉(zhuǎn)導(dǎo)測(cè)試，效果如圖：
載體家測(cè)試 AAV1-CMV-EGFP 和 AAV9-CMV-EGFP 對(duì)小鼠肌肉的轉(zhuǎn)導(dǎo)效果。取 6 周齡小鼠，尾靜脈注射，注射劑量約 1.51 x 1011 vg/g。注射后 12 天后 處死取材，制備冰凍切片，激光共聚焦顯微鏡觀察。
肌肉特異性啟動(dòng)子
載體家不僅提供廣泛表達(dá)啟動(dòng)子，如CMV、EF1A、EFS、CAG、CBh等，當(dāng)前還可以提供多種肌肉特異性啟動(dòng)子，幫助您 高效構(gòu)建肌肉特異表達(dá)的 AAV 載體。
| 啟動(dòng)子名稱(chēng) | 描述 | 組織噬性 | 細(xì)胞噬性 |
|---|---|---|---|
| Myog | Mouse myogenin promoter | Muscle | Myoblasts |
| ACTA1 | Human skeletal muscle actin α1 promoter | Muscle | Myocytes |
| MHCK7 | Composed of enhancer/promoter regions of murine muscle creatine kinase (MCK) and enhancer region of α-myosinheavy-chain genes. | Mouse skeletal and heart muscles | Di?erentiated postmitotic striated muscle cells |
| SM22α | Mouse transgelin (a.k.a. Sm22α) promoter | Adult smooth muscle | Vascular smooth muscle cells |
| EnSM22α | The chimeric vascular smoothmuscle-speci?c enhancer/promoter (The rabbit myosin heavy-chain enhancer inserted upstream of a truncated mouse SM22α promoter) | Adult smooth muscle | Vascular smooth muscle cells |
病毒遞送方法
向肌肉組織遞送 AAV 病毒載體通常分為局部的原位注射和系統(tǒng)性注射兩大類(lèi)。根據(jù)不同治療目的，病毒載體的遞送方法有差異。由于一般的肌肉疾病是全身性的，因此系統(tǒng)性注射是較好的策略。AAV8 和 AAV9 已被大量研究驗(yàn)證，在系統(tǒng)性注射后可以高效轉(zhuǎn)導(dǎo)多種肌肉組織，如骨骼肌、心肌等。但是在一些需要利用肌肉組織分泌特定分子的治療中，如分泌凝血因子VIII、IX，則直接進(jìn)行肌肉注射。對(duì)于大塊質(zhì)量的肌肉組織，有時(shí)也采用逆行性經(jīng)靜脈肢體灌注的方法局部轉(zhuǎn)導(dǎo) AAV。關(guān)于肌肉的 AAV 病毒遞送方式總結(jié)如下表[6]：
| 方法 | 優(yōu)點(diǎn) | 不足 | 應(yīng)用疾病 | |
|---|---|---|---|---|
| 原位注射 | 肌肉注射 Intramuscular injection |
| 轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域無(wú)法覆蓋大塊肌肉組織 | α-1抗胰蛋白酶缺乏癥、肢帶型肌 營(yíng)養(yǎng)不良癥2D型、龐貝氏癥等 |
| 經(jīng)靜脈肢體灌注 Transvenous limb perfusion | 杜興氏肌肉營(yíng)養(yǎng)不良癥 | |||
| 冠狀動(dòng)脈內(nèi)灌注Intracoronary infusion | 心力衰竭、心肌梗塞、肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良 | |||
| 循環(huán)輸送Recirculating delivery | 心力衰竭 | |||
| 心內(nèi)膜注射 Transendocardial injection | 心力衰竭、杜興氏肌肉營(yíng)養(yǎng)不良癥 | |||
| 系統(tǒng)性注射 | 血管內(nèi)注射 Intravascular injection | 能對(duì)大塊肌肉組織乃至全身肌肉廣泛轉(zhuǎn)導(dǎo) | 注射后感染非靶組織需要很高的病毒載體劑量血清型選擇較少 | 面肩肱型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、心肌梗塞 |
| 腹腔注射 Intraperitoneal injection | 杜興氏肌肉營(yíng)養(yǎng)不良癥、肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良 | |||
肌肉組織結(jié)構(gòu)
肌肉是許多動(dòng)物體中重量最大的組織類(lèi)型，具有驅(qū)動(dòng)身體運(yùn)動(dòng)和保持身體姿勢(shì)等功能。對(duì)于脊椎動(dòng)物，肌肉分為骨骼肌（Skeletal muscle） 、平滑肌（Smooth muscle）和心?。–ardiac muscle）三大類(lèi)，其中骨骼肌是隨意?。╒oluntary muscle） ，其收縮可受意識(shí)控制。平滑肌和心肌是不隨意?。↖nvoluntary muscle） ，其收縮是自主發(fā)生的，不受意識(shí)控制。從外觀上看，骨骼肌和心肌具有平行的紋理結(jié)構(gòu)，因此也稱(chēng)為橫紋?。⊿triated muscle） 。從功能上看，骨骼肌附著 于骨骼上，可驅(qū)動(dòng)身體運(yùn)動(dòng)。平滑肌分布于血管和除心臟外的內(nèi)臟，有控制血管張力、負(fù)責(zé)腸道蠕動(dòng)等多種功能。心肌是心臟節(jié)律性收縮的動(dòng)力來(lái)源，讓心臟具備推送血液至全身的能力[7]。
肌肉組織的收縮是肌細(xì)胞長(zhǎng)度變化的結(jié)果。肌細(xì)胞由于其細(xì)長(zhǎng)外形因此也稱(chēng)為肌纖維。在不同類(lèi)型的肌肉中，肌纖維的形態(tài)和長(zhǎng)度有較大差異。在橫紋肌中，肌纖維中包含多個(gè)肌原纖維（Myo?bril）結(jié)構(gòu)。每個(gè)肌原纖維實(shí)質(zhì)是由多個(gè)平行的肌絲組成的圓柱形結(jié)構(gòu)，且包含較粗的和較細(xì)的兩種肌絲。其中粗肌絲是主要由肌球蛋白（Myosin）分子構(gòu)成的長(zhǎng)軸，細(xì)肌絲則主要由肌動(dòng)蛋白（Actin）組成。細(xì)肌絲結(jié)合于與其垂直的同樣以肌動(dòng)蛋白構(gòu)成的 Z 線（Z-disk）, 而粗肌絲交錯(cuò)與細(xì)肌絲結(jié)合。在偏正光顯微鏡下，兩個(gè) Z 線構(gòu)成的暗帶之間形成一個(gè)明帶，即肌節(jié)（Sarcomere）。肌節(jié)在光學(xué)顯微鏡下呈現(xiàn)為橫紋肌的紋理結(jié)構(gòu)。對(duì)于骨骼肌，當(dāng)肌肉接受到沿神經(jīng)傳遞的動(dòng)作電位后，肌細(xì)胞發(fā)生鈣離子內(nèi)流，然后經(jīng)一系列分子相互作用引發(fā)粗肌絲與細(xì)肌絲之間相互滑行。肌絲的牽引作用導(dǎo)致肌節(jié)變短，最終產(chǎn)生肌肉收縮現(xiàn)象[8]。
References
[1] Asher DR, Thapa K, Dharia SD, Khan N, Potter RA, Rodino-Klapac LR, Mendell JR. Clinical development on the frontier: gene therapy for duchenne muscular dystrophy. Expert Opin Biol Ther. 2020 Mar;20(3):263-274.
[2] Chamberlain K, Riyad JM, Weber T. Cardiac gene therapy with adeno-associaed virus-based vectors. Curr Opin Cardiol. 2017 May;32(3):275-282.
[3] Katz MG, Fargnoli AS, Weber T, Hajjar RJ, Bridges CR. Use ofAdeno-Associated Virus Vector for Cardiac Gene Delivery in Large-Animal Surgical Models of Heart Failure. Hum Gene Ther Clin Dev. 2017 Sep;28(3):157-164.
[4] Qiao C, Koo T, Li J, Xiao X, Dickson JG. Gene therapy in skeletal muscle mediated by adeno-associated virus vectors. Methods Mol Biol. 2011;807:119-40.
[5] Duan D. Systemic AAV Micro-dystrophin Gene Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy. Mol Ther. 2018 Oct 3;26(10):2337-2356.
[6] Wang D, Zhong L, Nahid MA, Gao G. The potential of adeno-associated viral vectors for gene delivery to muscle tissue. Expert Opin Drug Deliv. 2014 Mar;11(3):345-364.
[7] Muscle. (n.d.). https://www.britannica.com/science/muscle.
[8] Muscular. IMHOTEP VIRTUAL MEDICAL SCHOOL. (2014, May 14). https://drimhotepmd.wordpress.com/muscular.
