在過(guò)去的幾十年間， 復(fù)制缺陷的人類(lèi)重組腺病毒V5（HadV5） 已 經(jīng)成為一種廣泛應(yīng)用在真核基因表達(dá)分析、疫苗研究和基因治療等 領(lǐng)域的模式系統(tǒng)。 這種經(jīng)修飾后的腺病毒，其E1和E3基因已被移 除，依然具備細(xì)胞感染的能力。而用于產(chǎn)生新的病毒顆?；蛘哒f(shuō)病毒粒子的必需基因不復(fù)存在。

利用腺病毒將基因物質(zhì)傳遞到宿主細(xì)胞具有很多優(yōu)勢(shì)。在體內(nèi)以及 體外，重組腺病毒都能被用于轉(zhuǎn)導(dǎo)多種哺乳動(dòng)物（尤其是人類(lèi)）的 分裂期細(xì)胞和休眠細(xì)胞。此外，重組腺病毒還能用于轉(zhuǎn)導(dǎo)多種類(lèi)型 的敏感型細(xì)胞。

人類(lèi)AdV5感染起始于纖維蛋白與細(xì)胞表面的coxsackie腺病毒受體 （coxsackie-adenovirus receptor， CAR）高度親和性的結(jié)合。 與CAR受體初始作用之后，腺病毒亞基上一個(gè)暴露的RGD結(jié)構(gòu)域與 細(xì)胞表面的av整聯(lián)蛋白相結(jié)合而觸發(fā)內(nèi)吞作用，病毒顆粒通過(guò)該內(nèi) 吞作用發(fā)生內(nèi)化。內(nèi)化之后， 衣殼蛋白繼續(xù)分裂并釋放出蛋白VI， 該蛋白將衣殼蛋白從核內(nèi)體中釋放出來(lái)進(jìn)入細(xì)胞液， 并與動(dòng)力蛋白 相互作用，之后通過(guò)動(dòng)力蛋白依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)方式沿著微管到達(dá)核孔復(fù) 合體（NPC）。病毒顆粒與NPC上蛋白的聯(lián)合似乎進(jìn)一步推動(dòng)了病毒顆粒的脫殼，繼而允許基因組轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。

進(jìn)入細(xì)胞核之后，病毒DNA保持染色體游離狀態(tài)（病毒DNA不與 宿主染色體進(jìn)行整合，因而不會(huì)引起宿主基因的活化或者失活）。

圖1. 腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的示意圖。

下表為定制化腺病毒產(chǎn)品的交付內(nèi)容。可在相關(guān)COA（Certificate of analysis document）文件查看病毒滴度。

若病毒被用于體外細(xì)胞培養(yǎng)，則無(wú)需進(jìn)行超純化處理。 若被用于體內(nèi)研究 （即動(dòng)物研究），則必須進(jìn)行超純化處理以去除有缺陷的病毒顆粒、 細(xì)胞碎片以及少量的培養(yǎng)基， 這些污染物會(huì)引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。 此外，超純化可將病毒濃縮用于體內(nèi)注 射的適宜濃度。

1. 腺病毒產(chǎn)品使用干冰冷藏運(yùn)輸。收到病毒后，可直接放置-80°C冷凍保存至少1年，也可放置-20°C冷凍保存2-3周。

2. 使用前，將病毒液放置冰上進(jìn)行融解。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，亦需保持冰上放置。融解后的腺病毒液可放置4°C保存1-2周（在4°C 條件下，腺病毒比慢病毒相對(duì)穩(wěn)定，一般不會(huì)出現(xiàn)顯著的活性降低問(wèn)題）。

3. 若實(shí)際用量較少，可將融解的腺病毒少量分裝多管，再放置-80°C冷凍保存。如果您需要對(duì)腺病毒進(jìn)行稀釋?zhuān)?qǐng)使用 PBS現(xiàn)稀釋現(xiàn)用。

注意： 應(yīng)避免反復(fù)凍融。雖然反復(fù)凍融2-3次不會(huì)使腺病毒滴度出現(xiàn)嚴(yán)重下降問(wèn)題，但是請(qǐng)盡量避免反復(fù)凍融。

所有VectorBuilder的腺病毒載體均缺失了E1A、E1B和E3基因。E1A和E1B是產(chǎn)生活病毒所必需的， 已通過(guò)生物工程的方法 導(dǎo)入包裝細(xì)胞的基因組中。因此，此類(lèi)載體產(chǎn)生的腺病毒由于存在復(fù)制缺陷性而具有重要的安全特性，這也就意味著被感染的細(xì)胞不能復(fù)制出新的病毒顆粒。盡管如此，腺病毒本身具有轉(zhuǎn)導(dǎo)人原代細(xì)胞的能力，理論上仍有生物危險(xiǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。腺病毒作為常見(jiàn)的人類(lèi)病原體，可引發(fā)呼吸道炎癥、角膜損傷和角膜結(jié)膜損傷等。我們建議按照BSL-2規(guī)范（Biosafety Level-2， 二級(jí)生物安全防護(hù)水平） 對(duì)腺病毒進(jìn)行操作。所有的操作、 儲(chǔ)存以及生物廢料的處理均需依照公共機(jī)構(gòu)發(fā)布的和所處機(jī)構(gòu)制定的規(guī)范條例。建議用戶勿生產(chǎn)致癌的活腺病毒。

通過(guò)側(cè)尾靜脈進(jìn)行靜脈注射是一種將重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)到小鼠肝臟的有效方式。該方法簡(jiǎn)單，無(wú)需進(jìn)行手術(shù)和麻醉。其他的注射點(diǎn)還包括門(mén)靜脈和頸靜脈。但是，門(mén)靜脈注射需要手術(shù)； 在將腺病毒運(yùn)送到肝臟中，較之于尾靜脈注射，該方法的效果并未顯著增強(qiáng)。

為確定適用于您研究的最佳注射效果，您需要在動(dòng)物中利用報(bào)告腺病毒進(jìn)行位點(diǎn)測(cè)試，如表達(dá)EGFP的腺病毒。

• 成年小鼠，20~25 g重，至少6周齡
• 超純化腺病毒
• 70%乙醇
• 熱源
• 小鼠專(zhuān)用固定器
• 紗布
• 0.5 ml注射器＋27 guage 1/2 inch針頭

1. 物理固定

• 可利用一種商品的固定器將小鼠進(jìn)行物理固定。溫和地將待注射的小鼠引誘到固定器內(nèi)，暴露出鼠尾以便進(jìn)行后續(xù)操作。

2. 血管舒張

• 溫暖小鼠誘導(dǎo)周?chē)苁鎻垼稍谧⑸淝皩⑹笪步](méi)于熱水中（43°C）或者將動(dòng)物放置在靠近熱燈源的位置5~10分鐘。
• 注意：使用熱燈源時(shí)，將燈源放置在鼠籠15~25 cm處，觀察小鼠5分鐘。若小鼠均聚集到籠子中的某個(gè)角落，立即停止 供熱。

3. 注射

• 保證小鼠放置固定器中胸骨的位置。輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)尾部以能看到側(cè)尾靜脈。用70%乙醇對(duì)待注射位點(diǎn)進(jìn)行消毒并用紗布擦拭 多余的乙醇。
• 使用帶有27 guage針頭的0.5ml注射器，吸取至少0.1 ml 滴度為2×10¹¹ ~1×10¹² VP/ml的超純化腺病毒顆粒（病毒顆粒總量約2~10×10¹⁰個(gè)）。小心擠出針頭中的空氣。
  抓住遠(yuǎn)端尾部并輕輕轉(zhuǎn)向一邊以能看到側(cè)面靜脈 （見(jiàn)圖2）。 以較小的角度插入針頭（尾靜脈相對(duì)靠近表皮）， 將0. 1 ml稀釋后的重組腺病毒注射到靜脈中。若針頭定位準(zhǔn)確，則注射過(guò)程暢通無(wú)阻，且靜脈顏色呈現(xiàn)短暫的清晰狀態(tài)。一旦觀察到局部隆起或者局部紅腫，則立即停止注射，這種情況是病毒被注射到了尾部組織而非靜脈。

  注意： 在尾部底端距離尾尖約1/3處開(kāi)始注射。這樣一旦之前注射失敗，您可以向前移動(dòng)尾部再次注射。

  

  圖2. 小鼠尾外側(cè)靜脈和腹動(dòng)脈橫切面圖。

• 移除針頭，用干凈紗布按壓注射點(diǎn)直至停止出血。
• 將小鼠轉(zhuǎn)移回原來(lái)的鼠籠。

4. 驗(yàn)證

• 腺病毒顆粒在靜脈注射后絕大多數(shù)會(huì)被肝臟隔離。為判斷體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率，可在病毒注射72h后處死小鼠，處理肝臟來(lái)進(jìn)行分析。

結(jié)果

圖3所示體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的成功案例。

圖3. 利用文中方案，用表達(dá)EGFP的超純化腺病毒注射小鼠，病毒量為 2×10¹⁰個(gè)。注射7天后，取注射動(dòng)物的2/3肝臟用于分析。圖片40×。左：明視野；右圖：EGFP。