與游離的病毒不同（例如單純性皰疹病毒，腺病毒），逆轉(zhuǎn)錄病毒具有能將遺傳物質(zhì)整合到宿主基因組的能力，使轉(zhuǎn)基因能夠穩(wěn)定、長期地表達。因此，簡單的逆轉(zhuǎn)錄病毒（即所謂的γ或者致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒）在當代生物醫(yī)學(xué)中扮演了重要角色。但是，簡單逆轉(zhuǎn)錄病毒不能感染非分裂細胞以及有誘發(fā)癌癥的風(fēng)險的這些特點限制了它們的應(yīng)用。使用慢病毒能夠繞過簡單逆轉(zhuǎn)錄病毒的這些短板。慢病毒是一類復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)錄病毒，除包含gag、pol和env這些簡單逆轉(zhuǎn)錄病毒的常規(guī)基因外，還包含額外的調(diào)控基因和輔助基因。與簡單逆轉(zhuǎn)錄病毒不同的是，慢病毒能感染分裂和非分裂細胞，大大增加了基因可轉(zhuǎn)移的細胞范圍。慢病毒傾向整合到染色體中的內(nèi)含子區(qū)域（表達基因富含內(nèi)含子），而簡單的逆轉(zhuǎn)錄病毒則更偏好啟動子和調(diào)控區(qū)域。廣泛使用的慢病毒載體是通過將人類免疫缺陷病毒類型1（HIV-1）工程化而來的。

HIV-1結(jié)構(gòu)

HIV-1病毒粒子大致呈球形，直徑約為100 nm，外面包裹著在出芽過程中從宿主細胞衍生而來的脂質(zhì)雙層膜。該包膜表面攜帶許多小的糖蛋白凸起物。病毒通過這些糖蛋白識別新的宿主細胞。脂質(zhì)層下的基質(zhì)蛋白覆蓋病毒包膜的內(nèi)表面，形成一個保護殼。在病毒粒子的內(nèi)部，是一個由結(jié)構(gòu)蛋白組裝成的錐形衣殼，里面裝載著病毒基因組。兩條長度為9.2Kb的單鏈RNA基因組、核衣殼蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶以及整合酶被共同裝載在衣殼中。

圖1. HIV-1結(jié)構(gòu)

HIV-1基因組

HIV-1基因組是單組分、線性、二聚體的ssRNA（+），長度約為9.2Kb（HIV-1前病毒基因組的大小約為9.7Kb），帶有5’帽子和3’poly-A尾。蛋白編碼區(qū)側(cè)翼序列為5’和3’長末端重復(fù)序列（LTR）。LTR包含3’特異元件（U3）、重復(fù)元件（R）和5’特異元件（U5），還包含一些順式作用元件。一個病毒的RNA基因組起始于5’LTR 中R區(qū)的第一個核苷酸，終止于3’LTR中R區(qū)的最后一個核苷酸，包括了編碼19種蛋白產(chǎn)物的9種基因。gag、pol和env基因編碼所有逆轉(zhuǎn)錄病毒具有的常規(guī)結(jié)構(gòu)蛋白和酶。其他額外的基因編碼必需的調(diào)控蛋白（tat和rev基因）和輔助蛋白（vif、vpu、vpr和nef基因）。由于病毒基因組很緊湊，HIV-1通過利用宿主細胞的RNA剪接機器來表達數(shù)量眾多的基因。

圖2. HIV-1基因組

HIV-1生命周期

當病毒包膜上的糖蛋白gp120與宿主細胞表面的CD4受體和一個二級受體結(jié)合時，病毒開始復(fù)制。這種連續(xù)的結(jié)合觸發(fā)了病毒和宿主細胞膜的融合，隨后將病毒核心釋放到宿主細胞的細胞質(zhì)中。一旦進入，病毒衣殼遭遇“脫殼”，在此期間大多數(shù)的衣殼脫落，而核衣殼、病毒蛋白R、整合酶以及一小部分基質(zhì)仍連在一起。隨著脫殼過程的不斷進行，病毒基因組RNA（gRNA）逆轉(zhuǎn)錄成互補DNA（cDNA），新合成的病毒cDNA以先導(dǎo)整合復(fù)合體（PIC）的形式保持與病毒和細胞蛋白的聯(lián)系。當逆轉(zhuǎn)錄全部完成之后，一段長度約為100 nt的三鏈DNA（被稱為中心DNA瓣）在cPPT/CT區(qū)域形成，它是病毒DNA核運輸所必需的。PIC通過核孔復(fù)合體（NPC）進入細胞核內(nèi)而不會破壞核膜，然而許多其他逆轉(zhuǎn)錄病毒則需要在有絲分裂時期借助核膜的破壞來接近宿主染色體。一旦進入細胞核內(nèi)，PIC即發(fā)生解體，HIV整合酶將病毒cDNA整合到宿主細胞的基因組中。

病毒DNA整合之后，HIV前病毒能夠保持轉(zhuǎn)錄沉默，或者激活轉(zhuǎn)錄進入生命周期的完成階段。HIV基因組轉(zhuǎn)錄涉及RNA聚合酶II（RNAP II）與病毒蛋白Tat以及一些宿主蛋白共同合作。病毒啟動子5’LTR中有能夠被RNAP II激活的啟動子的經(jīng)典結(jié)構(gòu)。在Tat缺乏的情況下，從LTR的轉(zhuǎn)錄啟動盡管有效，但會因為啟動子與進行性聚合酶結(jié)合不良以及這些酶過早的從DNA模板上脫落而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄受損。Tat蛋白最初是從已整合的病毒DNA表達，并且與早期的RNA轉(zhuǎn)錄本中的TAR發(fā)夾結(jié)構(gòu)相結(jié)合，增加RNAP II的持續(xù)合成能力。病毒RNA的轉(zhuǎn)錄開始于5’LTR中R區(qū)的第一個核苷酸，多聚腺苷酸化發(fā)生在3’LTR中R區(qū)的最后一個核苷酸。前病毒DNA經(jīng)RNAP II轉(zhuǎn)錄生成一條未剪接的長鏈RNA，既能被用作包裝進病毒粒子中的gRNA，還可以作為Gag和Gag-Pol轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄本，或者經(jīng)剪接產(chǎn)生超過40個不同的mRNA以被用于產(chǎn)生余下的病毒蛋白。HIV-1轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白（包括Rev）由加工完全的mRNA轉(zhuǎn)錄本翻譯而來，而結(jié)構(gòu)蛋白則是由不完全剪接的轉(zhuǎn)錄本翻譯而來。完全剪接的轉(zhuǎn)錄本通過與細胞內(nèi)mRNA相同的機制由細胞核運輸?shù)郊毎|(zhì)中。一般而言，包含內(nèi)含子的RNA（未剪接的或者不完全剪接）被保留在細胞核內(nèi)。然而，HIV-1已經(jīng)發(fā)展出了一套特別的機制，即利用Rev調(diào)控蛋白與一個結(jié)構(gòu)化的順式作用RNA元件也就是熟知的Rev反應(yīng)元件（RRE）相結(jié)合來克服這個問題。

一經(jīng)進入細胞質(zhì)中，未剪接的gRNA采用以下兩種途徑中的一種：1)作為一個mRNA模板用于翻譯Gag蛋白，以及通過核糖體移碼翻譯成Gag-Pol，以編碼病毒蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶以及整合酶；2）作為gRNA被包裝成病毒粒子。兩條HIV gRNA被包裝成一個二聚體，在5’末端（這些序列即為Ψ（psi），用作“包裝信號”）附近以非共價連接方式結(jié)合。Ψ元件僅存在于未剪接的gRNA中。在單體gRNA中，Ψ元件被分子內(nèi)堿基對隱藏起來，之后經(jīng)2個拷貝的gRNA二聚化才會暴露出來，以允許未剪接的gRNA二聚體與Gag多聚蛋白的NC區(qū)特異性的、高度親和的結(jié)合。多條Gag多聚蛋白能與gRNA的一個二聚體相互作用。該復(fù)合體被肌動蛋白或者微管運輸?shù)阶罱K病毒粒子組裝和出芽發(fā)生的細胞膜。病毒粒子一旦釋放，蛋白酶被激活并將Gag和Gag-Pol裂解成單鏈，在病毒粒子內(nèi)部自我組裝形成衣殼，導(dǎo)致有感染性的病毒顆粒的產(chǎn)生。

慢病毒包裝系統(tǒng)

通過瞬時轉(zhuǎn)染編碼病毒組件的質(zhì)粒，重組慢病毒顆粒能夠從正確包裝的細胞中生產(chǎn)出來。慢病毒包裝系統(tǒng)建立于一個“切割”系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中自然的病毒基因組序列被分割后裝進幾個單獨的輔助質(zhì)粒，這樣增加了慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗的安全性。第三代包裝系統(tǒng)所需的元件包括：

轉(zhuǎn)移載體

轉(zhuǎn)移質(zhì)粒表達全長的gRNA，該gRNA包含用于有效包裝、逆轉(zhuǎn)錄、核運輸和整合到宿主基因組DNA所必須的所有順式作用元件。通常，該質(zhì)粒包含一個攜帶由內(nèi)部啟動子驅(qū)動的目的基因的轉(zhuǎn)基因表達盒。早期的載體包含完整的5’和3’LTR。因而轉(zhuǎn)錄是Tat依賴的，并且病毒能夠自我復(fù)制。為了進一步提高包裝慢病毒的生物安全性，不依賴Tat的病毒gRNA轉(zhuǎn)錄通過用一個強的異源性啟動子（例如RSV啟動子）替代5’LTR中U3區(qū)的增強子/啟動子序列來得以實現(xiàn)。此外，3’LTR中的大部分U3區(qū)被刪除掉。該U3缺失體在逆轉(zhuǎn)錄時能被復(fù)制到5’LTR，使得前病毒自我復(fù)制失效（所謂的“自我失活”）。

包裝質(zhì)粒

包裝質(zhì)粒能表達感染顆粒形成所必需（除Env之外）的病毒酶和結(jié)構(gòu)蛋白。早期的第一代慢病毒載體系統(tǒng)的包裝質(zhì)粒含有輔助蛋白和調(diào)控蛋白的表達元件。為盡量減少生產(chǎn)和使用慢病毒載體的相關(guān)風(fēng)險，所有編碼輔助蛋白和與細胞毒性相關(guān)的非必需基因均被移除，第三代包裝系統(tǒng)由此產(chǎn)生。在該系統(tǒng)中，包裝元件被分隔在兩個質(zhì)粒中，一個Gag-Pol表達質(zhì)粒和一個Rev表達質(zhì)粒，盡可能的降低一個具有復(fù)制能力的慢病毒（RCL）重新形成的風(fēng)險。

包膜載體

包膜載體能表達一個異源性糖蛋白，即水泡性口膜炎病毒糖蛋白(VSV-G)，該蛋白能與細胞表面廣泛存在的磷脂組分而不是一個特異性的細胞表面受體相結(jié)合。此類病毒宿主細胞的范圍十分廣泛，包含的細胞類型例如有神經(jīng)元、淋巴細胞和巨噬細胞。此外，VSV-G增加了病毒顆粒的物理穩(wěn)定性，以允許使用高速離心對病毒進行濃縮。

圖3. 第三代慢病毒包裝系統(tǒng)

轉(zhuǎn)染用慢病毒載體的產(chǎn)品規(guī)格、運輸方式和儲存條件在下表中列出。

• 轉(zhuǎn)染用包裝混合物包含了優(yōu)化混合的第三代包裝質(zhì)粒和VSV-G衣殼表達載體。這些質(zhì)粒提供輔助功能以及產(chǎn)生VSV-G慢病毒所必需的結(jié)構(gòu)和復(fù)制蛋白。
• 轉(zhuǎn)染用EGFP慢病毒載體包含一個EGFP表達盒。該表達盒能夠包裝進病毒顆粒，進而轉(zhuǎn)導(dǎo)進哺乳動物細胞。利用該質(zhì)粒，可實時測量轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，從而優(yōu)化病毒包裝和細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗。
• 轉(zhuǎn)染用的scramble shRNA慢病毒載體包含一個scramble shRNA表達盒和一個EGFP表達盒。這些表達盒能夠包裝進病毒顆粒，進而轉(zhuǎn)導(dǎo)進哺乳動物細胞。該質(zhì)?？捎米鱎NAi實驗的陰性對照。

我們建議在實驗中使用EGFP慢病毒載體作為對照組來幫助您評估實驗結(jié)果。當您從我們的載體工匠網(wǎng)站（vectorbuilder.com）訂制病毒包裝服務(wù)時，即可免費獲得EGFP慢病毒。

1. 轉(zhuǎn)染前一天（第0天）

• 將293T HEK細胞接種在10 cm組織培養(yǎng)皿中，保證在轉(zhuǎn)染當天細胞匯合度達到90-95%。我們建議在10 ml包含血清的生長培養(yǎng)基中接種5 × 10⁶個細胞。
  注意：培養(yǎng)基中不含抗生素。
• 保持培養(yǎng)皿水平的同時，前后左右地搖晃培養(yǎng)皿，讓細胞均勻地鋪滿整個培養(yǎng)皿；在37°C，5% CO₂ 培養(yǎng)箱中孵育過夜。
• （可選）用多聚L-賴氨酸預(yù)處理培養(yǎng)皿表面以增強293T HEK細胞與培養(yǎng)皿之間的粘性。每個培養(yǎng)皿中加入10 ml 多聚L-賴氨酸，室溫下孵育15分鐘并棄掉液體。

2. 轉(zhuǎn)染當天（第1天）

• 轉(zhuǎn)染前當天觀察接種的培養(yǎng)皿。當細胞匯合度達到90-95%時可準備轉(zhuǎn)染。此時細胞之間仍有1-2次細胞分裂的空間。
• 移除培養(yǎng)液，替換成8 ml無抗生素的血清生長培養(yǎng)基。
• 在5 ml離心管中加入包裝混合物和轉(zhuǎn)移載體來準備質(zhì)粒DNA混合物。對于10 cm的培養(yǎng)皿，使用15 ug轉(zhuǎn)移載體和20 ug的包裝混合物。
• 將轉(zhuǎn)染混合物一滴一滴地加入到細胞中，鋪滿整個培養(yǎng)皿。輕柔旋轉(zhuǎn)細胞，在37°C、5% CO₂ 培養(yǎng)箱中孵育過夜。
  注意：在5%的CO₂中孵育是必需的，這是由于轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基的pH會影響CaPO4沉淀物形成的效率。

3. 轉(zhuǎn)染后一天（第2天）

• 觀察細胞。若轉(zhuǎn)移載體包含一個熒光標記（例如EGFP），則通過在熒光顯微鏡下觀察熒光細胞來檢查轉(zhuǎn)染效率。通常情況下，超過90%的細胞被轉(zhuǎn)染。
  注意：VSV-G糖蛋白會導(dǎo)致293T HEK細胞融合，而造成多核的合胞體的出現(xiàn)。這種形態(tài)學(xué)上的變化屬于正?，F(xiàn)象，不會影響慢病毒的產(chǎn)生。如果沒有觀察到合胞體，則病毒的產(chǎn)出有可能受影響。
• 移除含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，替換成10 ml不含抗生素的完全培養(yǎng)基。
• 37°C、5% CO₂ 培養(yǎng)箱中孵育。

4. 第3-4天

• 轉(zhuǎn)染后48-72小時（第3-4天），將培養(yǎng)基移入一個15 ml 帶蓋的圓錐形無菌管中，收集含有病毒的上清液。
  警告：請記住此時您正在操作有感染性的病毒。請按照BSL-2條例操作。
• 4°C、3000 rpm離心病毒上清液15分鐘沉淀細胞碎片。
• 用0.45 um濾膜進一步過濾病毒上清液中的細胞碎片。初步處理后的病毒上清液可直接轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞，也可根據(jù)您的實驗需求進一步濃縮或者純化病毒。