在過(guò)去的幾十年間，HIV-1依賴的有缺陷的慢病毒已經(jīng)成為目前應(yīng)用最廣泛的基因轉(zhuǎn)移載體之一。慢病毒是一種含有二倍體正鏈RNA基因組的包膜病毒。一經(jīng)感染宿主細(xì)胞，該病毒即利用反轉(zhuǎn)錄酶將其RNA轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，隨后永久的整合到宿主細(xì)胞的染色體中。

修飾后的慢病毒已被移除所有的病毒結(jié)構(gòu)基因，僅保留LTR序列和包裝信號(hào)以用于導(dǎo)入治療基因，仍然具有細(xì)胞感染能力。不過(guò)產(chǎn)生新的病毒顆粒所需的病毒基因不復(fù)存在。為提高病毒安全性，轉(zhuǎn)移載體3’LTR也存在缺失，保證病毒整合后仍保持“自身滅活”（SIN）。

重組慢病毒最具優(yōu)勢(shì)的特征在于能夠有效調(diào)控基因物質(zhì)在分裂細(xì)胞和不分裂細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)、整合以及長(zhǎng)期表達(dá)。先導(dǎo)整合復(fù)核體（PIC）能夠允許慢病毒通過(guò)核孔復(fù)合體（NPC）來(lái)跨越核膜，提升慢病毒感染非分裂細(xì)胞的能力。其他大多數(shù)的反轉(zhuǎn)錄病毒則需要在有絲分裂期核孔破裂時(shí)達(dá)到宿主的核染色質(zhì)。由于大多數(shù)的細(xì)胞類型在體內(nèi)被認(rèn)為是靜止的，因此重組慢病毒成為了許多體內(nèi)應(yīng)用的選擇。再者，與腺病毒不同的是，慢病毒在體內(nèi)不具有免疫原性。

CD4是與自然的HIV包膜糖蛋白結(jié)合的主要受體，因此慢病毒載體的靶向性十分受限。CD4受體僅僅位于免疫細(xì)胞的表面。為感染不表達(dá)CD4的細(xì)胞，載體通過(guò)水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）假病毒化，VSV-G作為一種棒狀病毒包膜蛋白能夠與細(xì)胞質(zhì)膜表面廣泛存在的磷脂組分而不是某些特異細(xì)胞表面受體相結(jié)合。這類病毒均具有廣泛的宿主細(xì)胞范圍，包含神經(jīng)元細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等細(xì)胞類型。而之前，反轉(zhuǎn)錄病毒是不能被用于這些細(xì)胞類型的。再者，慢病毒載體已被證明能在體內(nèi)有效轉(zhuǎn)導(dǎo)腦、肝臟、肌肉以及視網(wǎng)膜。

一個(gè)慢病毒顆粒通過(guò)細(xì)胞表面結(jié)合進(jìn)入宿主細(xì)胞。釋放病毒RNA基因組并反轉(zhuǎn)錄合成DNA。隨后DNA通過(guò)病毒整合酶隨機(jī)整合到宿主基因組中。

圖1. 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的簡(jiǎn)要示意圖

下表為定制化慢病毒產(chǎn)品的交付內(nèi)容。可在相應(yīng)COA（Certificate of analysis document）文件查看病毒滴度。

* 表格所示產(chǎn)品規(guī)格適用范圍為一般慢病毒載體。

若病毒被用于體外細(xì)胞培養(yǎng)，則無(wú)需進(jìn)行超純化處理。若被用于體內(nèi)研究（即動(dòng)物研究），則必須進(jìn)行超純化處理以去除有缺陷的病毒顆粒、細(xì)胞碎片以及少量的培養(yǎng)基，這些污染物會(huì)引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。此外，超純化可將病毒濃縮到體內(nèi)注射的適宜濃度。

1. 慢病毒產(chǎn)品使用干冰冷藏運(yùn)輸。收到病毒后，可直接放置-80°C冷凍保存至少6個(gè)月，也可放置-20°C冷凍保存一周。將Polybrene放置-20°C冷凍保存，也可放置4°C保存兩周。

2. 使用前，將病毒液放置冰上進(jìn)行融解。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，亦需保持冰上放置。慢病毒在高溫條件下失活較快。

3. 若實(shí)際用量較少，可將融解的慢病毒小量分裝多管，再放置-80°C冷凍保存。但需要注意的是，每一次凍融都會(huì)導(dǎo)致滴度下降（約20%）。

注意：應(yīng)避免反復(fù)凍融，以免造成滴度大幅降低。

所有VectorBuilder的慢病毒載體均是自我失活型，這意味著被感染的細(xì)胞不能復(fù)制出新的病毒顆粒。這是由于病毒中的基因組缺失了病毒復(fù)制相關(guān)基因?qū)е碌?。盡管如此，慢病毒本身具有轉(zhuǎn)導(dǎo)人原代細(xì)胞的能力，理論上仍有生物危險(xiǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。我們建議按照BSL-2規(guī)范（Biosafety Level-2，二級(jí)生物安全防護(hù)水平）對(duì)慢病毒進(jìn)行操作。所有的操作、儲(chǔ)存以及生物廢料的處理均需依照公共發(fā)布的和所處機(jī)構(gòu)制定的規(guī)范條例。

示蹤物或者工程化病毒在嚙齒動(dòng)物腦內(nèi)的注射，通過(guò)靶向大腦特定局域顯著增強(qiáng)了我們對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的理解。這些技術(shù)目前已被普遍應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)科學(xué)。 計(jì)劃使用慢病毒進(jìn)行腦內(nèi)注射時(shí)，需要考慮的一個(gè)重要方面是病毒顆粒在大腦包外細(xì)胞空間（ECS）中的擴(kuò)散程度。脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞間的ECS被估測(cè)＜40 nm。AAV病毒直徑約為20 nm，與之不同的是，慢病毒顆粒則要大的多（直徑接近100 nm），顆粒大小可能極大的限制了它們?cè)诖竽X中的自由擴(kuò)散。 為判斷研究中最適的注射量，您需要使用報(bào)告慢病毒（如表達(dá)EGFP的慢病毒）在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。

1. 試劑

• 超純化慢病毒（推薦病毒滴度為＞1×10⁹ 個(gè)感染顆粒/ml）
• 小鼠或者大鼠
• 消毒劑（70%乙醇）
• 麻醉劑和止痛劑（例如氯胺酮等）
• 潤(rùn)滑劑眼藥膏
• PBS
• 骨蠟

2. 設(shè)備

• 電動(dòng)剃須刀
• 外科手術(shù)工具，包括小外科手術(shù)刀和剪刀，精細(xì)鉗子和手術(shù)鉤
• 小動(dòng)物腦立體定位儀
• 解剖顯微鏡
• 棉簽
• 帶小型牙鉆的手持鉆機(jī)
• 10 ul注射器＋33 guage針頭
• 10 ul注射器＋27 guage針頭
• 手術(shù)縫合線
• 可溫控鼠籠
• 電熱毯

1. 麻醉

• 給動(dòng)物稱重，確定所用麻醉劑劑量。例如氯胺酮-甲苯噻嗪混合物，成年小鼠以及大鼠用量通常為每千克體重80~10mg氯胺酮和10 mg甲苯噻嗪。
• 通常使用腹腔注射法麻醉動(dòng)物。
• 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放置在電熱毯上以維持體溫穩(wěn)定。
• 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物需在10分鐘內(nèi)進(jìn)入深度麻醉。通過(guò)夾鼠尾方法檢測(cè)動(dòng)物對(duì)刺激的反應(yīng)以確定麻醉深度。

2. 動(dòng)物準(zhǔn)備

• 刮掉頭蓋骨上的毛發(fā)
• 用70%乙醇擦拭皮膚
• 手術(shù)中使用潤(rùn)眼膏避免角膜炎
• 用鑷子拔出舌頭以促進(jìn)呼吸

3. 動(dòng)物固定

• 為將動(dòng)物固定在腦立體定位儀中，在腦立體定位儀上安裝一個(gè)耳棒，溫柔地牽引動(dòng)物頭部以將其耳道放在耳棒之上，保持動(dòng)物的頭部位置，隨后緩慢放置好第二根耳棒以完成固定。
• 緩慢地將門牙適配器放入動(dòng)物嘴里，直到動(dòng)物的門牙被嵌入適配器開(kāi)孔中，之后輕柔的將適配器拉回并固定到位。
• 鼻夾是動(dòng)物的最后一個(gè)固定點(diǎn)，需要輕壓在動(dòng)物鼻子上。

圖2. 動(dòng)物固定示意圖

4. 開(kāi)顱手術(shù)

• 用一把小手術(shù)刀或者手術(shù)剪在動(dòng)物中線位置做切口。分離皮膚和肌肉組織并用小的手術(shù)鉤將該部位撐開(kāi)。
• 用棉簽清理頭蓋骨表面直到前鹵和λ區(qū)清晰可見(jiàn)。
• 用門牙適配器的螺釘調(diào)整動(dòng)物頭部位置，以保證動(dòng)物頭骨前端處于水平。
• 采用立體定位法，沿著三個(gè)軸向，分別從注射器前端開(kāi)始直到前囪點(diǎn)。標(biāo)記下坐標(biāo)軸，該點(diǎn)即為三個(gè)坐標(biāo)軸的零點(diǎn)。
• 壓低注射器尖端直至其接觸到頭蓋骨，用記號(hào)筆做好標(biāo)記。移走注射器以免造成損傷。
• 利用手持鉆機(jī)，采用輕微的下壓方式，削薄頭蓋骨靶位點(diǎn)區(qū)域（一個(gè)注射位點(diǎn)約1 mm×1 mm）。在打磨過(guò)程中，我們通常會(huì)使用40倍解剖顯微鏡。當(dāng)頭骨很薄時(shí)則停止打磨（此時(shí)腦膜血管清晰可見(jiàn)）。
• 用一個(gè)小針頭（27 guage）仔細(xì)地在手術(shù)切口邊緣穿孔。之后，用針頭尖端將變薄的頭骨翻開(kāi)后用精細(xì)的鑷子小心取出。用于注射的針頭能夠輕易的插入小鼠以及年輕大鼠的頭骨的硬腦膜中，因此無(wú)需把硬腦膜打開(kāi)。
• 用PBS保持暴露出的頭骨和硬腦膜濕潤(rùn)。

圖3. 小鼠頭骨立體定位

5. 慢病毒注射

• 吸取所需體積（一般4 ul）的慢病毒溶液。
• 將注射器放置在洞口上方，緩慢地垂直下移注射器直至觸到頭蓋骨表面。繼續(xù)降低注射器制其穿過(guò)硬腦膜。之后，繼續(xù)深入注射器直至到達(dá)腦實(shí)質(zhì)的理想深度。
• 設(shè)置數(shù)字泵參數(shù)為0.02 ml/min（0.5 ul體積在25 min內(nèi)注射完成）并開(kāi)始輸液。緩慢輸液可使病毒有效達(dá)到組織內(nèi)部以防回流。
• 注射完成后，需等待5 min以保證注射物擴(kuò)散到大腦而不是回流到注射器中。
• 緩慢移出注射器。

6. 傷口縫合和恢復(fù)

• 用濕潤(rùn)棉簽清潔注射點(diǎn)。較小的開(kāi)顱創(chuàng)口（小于1 mm×1 mm）無(wú)需使用骨蠟；對(duì)于較大的顱骨創(chuàng)口，需要在顱骨表面涂抹一層骨蠟。
• 拉緊皮膚邊緣，在三個(gè)不同的點(diǎn)對(duì)皮膚進(jìn)行縫合。
• 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安置在可進(jìn)行溫控的籠子中直到傷口完全恢復(fù)（手術(shù)后至少2周）。然后把動(dòng)物轉(zhuǎn)移回原來(lái)的籠子。