下表為定制化的超純化腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus, AAV）產(chǎn)品的交付內(nèi)容?？稍谙嚓P(guān)COA（Certi?cate of analysis document）?件查看病毒滴度。

注意：如果腺相關(guān)病毒應(yīng)?于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，超純化處理不是必須的。對(duì)于體內(nèi)研究（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)），使?超純化的、?雜質(zhì)（?活性 的病毒顆粒、細(xì)胞碎?和培養(yǎng)液成分）的腺相關(guān)病毒在避免引發(fā)強(qiáng)免疫反應(yīng)???關(guān)重要。此外，超純化處理可提升病毒滴度? 適合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的?平。

1. 腺相關(guān)病毒產(chǎn)品使??冰冷藏運(yùn)輸。收到病毒后，可直接放置-80°C冷凍保存?少1年， 也可放置-20°C冷凍保存2-3周。

2. 使?前，將病毒液放置冰上進(jìn)?融解。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，亦需保持冰上放置。融解后的腺相關(guān)病毒可放置4°C保存1-2周（在4°C條件 下，腺相關(guān)病毒?慢病毒相對(duì)穩(wěn)定，?般不會(huì)出現(xiàn)顯著的活性降低問(wèn)題）。

3. 若實(shí)際?量較少，可將融解的腺相關(guān)病毒少量分裝多管，再放置80°C冷凍保存。如果您需要對(duì)腺相關(guān)病毒進(jìn)?稀釋?zhuān)?qǐng)使? PBS現(xiàn)稀釋現(xiàn)?。

注意：應(yīng)避免反復(fù)凍融。腺相關(guān)病毒較之其他多種病毒更為穩(wěn)定，盡管反復(fù)凍融不會(huì)造成其活性顯著降低，但請(qǐng)盡量避免反復(fù)凍融。

所有VectorBuilder的腺相關(guān)病毒的基因組是由重組轉(zhuǎn)基因序列及其兩側(cè)的腺相關(guān)病毒反向末端重復(fù)序列（ITRs） 組成。 ITRs序列只占到了野?型腺相關(guān)病毒基因組序列的6%， 也是載體上唯?的腺相關(guān)病毒特異序列。?乎所有病毒結(jié)構(gòu)基因都被刪除掉， 這使得該病毒不能?我復(fù)制，唯有依賴(lài)腺病毒反式輔助進(jìn)?復(fù)制。我們使?輔助質(zhì)粒表達(dá)病毒復(fù)制相關(guān)基因，?不是腺病毒。通 過(guò)將3個(gè)質(zhì)粒（1個(gè)攜帶順式ITR元件的質(zhì)粒，1個(gè)編碼腺相關(guān)病毒復(fù)制酶和?殼蛋?的反式質(zhì)粒以及1個(gè)表達(dá)部分腺病毒基因的 輔助質(zhì)粒）同時(shí)瞬轉(zhuǎn)293T細(xì)胞制備出腺相關(guān)病毒顆粒。這種?法可制備出不同的?清型腺相關(guān)病毒。重組腺相關(guān)病毒是從對(duì)? 體沒(méi)有致病性的野?型病毒改造?成。野?型腺相關(guān)病毒的復(fù)制依賴(lài)于腺病毒或者皰疹病毒，?旦這些輔助病毒不存在，野?型 病毒會(huì)穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中。重組腺相關(guān)病毒通常主要以游離的形式存在于靶細(xì)胞中，整合效率極低。我們建議按照 BSL-2規(guī)范（BiosafetyLevel-2，?級(jí)?物安全防護(hù)?平）對(duì)腺相關(guān)病毒進(jìn)?操作。所有的操作、儲(chǔ)存以及?物廢料的處理均需依 照公共機(jī)構(gòu)發(fā)布的和所處機(jī)構(gòu)制定的規(guī)范條例。

注意：ITR區(qū)域來(lái)源于AAV2基因組。不同的?清型根據(jù)?殼蛋?區(qū)分。

側(cè)尾靜脈注射是在??體內(nèi)導(dǎo)?AAV的?效?法。尾靜脈注射操作簡(jiǎn)便，不需要?術(shù)或?醉步驟。其他注射位置，如注射?靜脈和頸靜脈，需要進(jìn)??術(shù)操作。尾靜脈注射對(duì)??靜脈注射可以更?效地將AAV遞送?組織。

為確定適?于您研究的最佳注射效果，您需要在動(dòng)物中利?表達(dá)報(bào)告基因的AAV病毒進(jìn)?位點(diǎn)測(cè)試，如表達(dá)EGFP的AAV病毒。

材料

• 成年??，20~25g重，?少6周齡
• 超純化腺相關(guān)病毒
• 75%?醇
• 熱源
• ??專(zhuān)?固定器
• 紗布
• 0.5ml注射器+ 27G（guage）1/2 英?針頭

操作流程

1. 物理固定

• 可利??種商品的固定器將??進(jìn)?物理固定。溫和地將待注射的??引誘到固定器內(nèi)，暴露出?尾以便進(jìn)?后續(xù)操作。

2. ?管舒張

• 溫暖??誘導(dǎo)周?chē)?管舒張，可在注射前將?尾浸沒(méi)于熱?中（43°C）或者將動(dòng)物放置在靠近熱燈源的位置5~10鐘。
• 注意：使?熱燈源時(shí)，將燈源放置在?籠15~25cm處，觀(guān)察??5分鐘。若??均聚集到籠?中的某個(gè)?落，?即停?供熱。

3. 注射

• 保證??放置固定器中胸?的位置。輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)尾部以能看到尾靜脈。?75%?醇對(duì)待注射位點(diǎn)進(jìn)?消毒并?紗布擦拭多余的?醇。
• 使?帶有27G針頭的0.5ml注射器， 吸取?少0.1ml 滴度為10¹² GC/ml的超純化腺相關(guān)病毒。??擠出針頭中的空?。
• 抓住遠(yuǎn)端尾部并輕輕轉(zhuǎn)向?邊以能看到側(cè)靜脈（?圖1）。以較?的?度插?針頭（尾靜脈相對(duì)靠近表?），將0.1ml稀釋后 的重組腺相關(guān)病毒注射到靜脈中。若針頭定位準(zhǔn)確，則注射過(guò)程暢通?阻，且靜脈顏?呈現(xiàn)短暫的清晰狀態(tài)。?旦觀(guān)察到局 部隆起或者局部紅腫，則?即停?注射，這種情況是病毒被注射到了尾部組織??靜脈。

  注意：在尾部底端距離尾尖約1/3處開(kāi)始注射。這樣?旦之前注射失敗，您可以向前移動(dòng)尾部再次注射。

• 

  圖1 ??尾側(cè)靜脈和腹動(dòng)脈橫切?圖。

• 移除針頭，??凈紗布按壓注射點(diǎn)直?停?出?。
• 將??轉(zhuǎn)移回原來(lái)的?籠。

4. 驗(yàn)證

• AAV病毒顆粒在進(jìn)?體內(nèi)注射前均經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證。為判斷體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率，可在病毒注射后第7天處死??，處理病毒感染的組織進(jìn)?分析。

預(yù)期結(jié)果

?個(gè)成功的AAV體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)果如圖2所?。

圖2 使?本?檔的?法??尾靜脈注射超純化的EGFP熒光AAV9， 劑量1x10¹³ GC/kg。注射后第?天，分離??肝臟進(jìn)?分 析。圖像使?熒光共聚焦顯微鏡拍攝。綠?：EGFP。藍(lán)?： DAPI。

腦室內(nèi)（Intra-cerebroventricular,ICV） 注射將超純化AAV注射?左、右側(cè)腦室，隨后AAV擴(kuò)散?中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Centralnervoussystem,CNS）。腦室和CNS含有由兩側(cè)腦室分泌的腦脊液（Cerebrospinal?uid,CSF）。腦脊液的流動(dòng)?向從腦室開(kāi)始，最后進(jìn)?蛛?膜下腔（圖3）進(jìn)?循環(huán)。由于蛛?膜覆蓋全腦、脊髓和骶?，ICV注射可以不受?腦屏障阻礙在CNS中導(dǎo)?AAV病毒樣本。

為確定適?于您研究的最佳注射效果，您需要在動(dòng)物中使??量表達(dá)報(bào)告基因的AAV病毒進(jìn)?測(cè)試，如表達(dá)EGFP的AAV病毒。

圖3 ??腦脊液循環(huán)通路?意圖

材料

• 新??，1-3歲周齡
• 超純化腺相關(guān)病毒
• 75% ?醇
• ???醇
• 冰
• ?冰
• 紗布
• 加熱墊或保溫箱
• ?體定位儀
• 33~34G（gauge） 1/2英?針頭
• 10ul注射器
• 15cm均壓(PE) 管

操作流程

1. 準(zhǔn)備?術(shù)環(huán)境

• 使?75%?醇擦拭?術(shù)臺(tái)。
• 對(duì)腦?體定位儀進(jìn)?降溫處理，往?術(shù)臺(tái)的凹槽內(nèi)加?5ml的???醇，不斷往???醇中添加?冰使實(shí)驗(yàn)臺(tái)保持0°C左右。同時(shí)對(duì)?型加熱墊進(jìn)?加熱。

  注意：為避免??死亡，?術(shù)環(huán)境溫度應(yīng)不低于0°C。

2. 準(zhǔn)備注射器

• 取?個(gè)33~34G針頭與PE管套緊，再將PE管的另外?端與10ul注射器針頭套緊。
• 使?針頭吸取5ul2x10¹² GC/ml超純化AAV， 然后??排出針頭中的空?。
• 將注射器和針頭固定于?體定位儀。

3. ?醉

• 將??放在冰上?醉4min，???基本保持不動(dòng)

4. 物理固定

• ?醉后，??頭部可以被物理固定于?體定位儀。

5. 注射

5.1 注射左腦室

• ?沾有75%?醇的紗布擦拭??的頭部。
• 將針頭移動(dòng)???的λ結(jié)構(gòu)上?（圖4）。記錄下x、y坐標(biāo)（x，y）。
• 移動(dòng)x和y軸的游標(biāo)卡尺確定左腦室的坐標(biāo)（x+1.2mm， y+1.6mm），先移動(dòng)z軸使針將??的頭蓋?刺穿，然后?刻回針，將針頭緩慢拔出。

  注意：當(dāng)針頭刺穿??頭蓋?后，由于針頭施加壓?的原因，可以稍微改變Z軸位置。刺穿頭蓋?后?即回針有助于幫助頭蓋 ?返回初始位置。

• C針頭拔出后??地再放回頭蓋?中，移動(dòng)z軸使針尖剛好與腦接觸，記錄下z軸的坐標(biāo)（x+1.2mm，y+1.6mm，z1）。 此時(shí)的坐標(biāo)往下移動(dòng)2.5~3mm是左腦室的位置，即（x+1.2mm，y+1.6mm，z-2.5~3mm）。
• 緩慢移動(dòng)z軸，使針尖緩慢扎?腦室，當(dāng)坐標(biāo)達(dá)到了之后，緩慢推動(dòng)微量注射器，直?注射完2.5ul的病毒樣本。注射完成后 等待1min。
• 緩慢地移動(dòng)z軸將針頭從腦室中拔出來(lái)。該動(dòng)作應(yīng)持續(xù)2min。過(guò)快拔出針頭可能會(huì)導(dǎo)致AAV病毒液漏出。

5.2注射右腦室

• 移動(dòng)針頭?右腦室上?（x-1.2mm,y+1.6mm）。通過(guò)移動(dòng)z軸讓針頭刺穿??頭蓋?。
• 頭蓋?被刺穿后?刻回針，將針頭緩慢拔出。
  注意：當(dāng)針頭刺穿??頭蓋?后，由于針頭施加壓?的原因，可以稍微改變Z軸位置。刺穿頭蓋?后?即回針有助于幫助頭蓋 ?返回初始位置。
• 針頭拔出后??地再放回頭蓋?中，移動(dòng)z軸使針尖剛好與腦接觸，記錄下z軸的坐標(biāo)（x+1.2mm，y+1.6mm，z1）。此時(shí)的坐標(biāo)往下移動(dòng)2.5~3mm是左腦室的位置，即（x-1.2mm，y+1.6mm，z-2.5~3mm）。
• 緩慢移動(dòng)z軸，使針尖緩慢扎?腦室，當(dāng)坐標(biāo)達(dá)到了之后，緩慢推動(dòng)微量注射器，直?注射完2.5ul的病毒樣本。注射完成后 等待1min。
• 緩慢地移動(dòng)z軸將針頭從腦室中拔出來(lái)。該動(dòng)作應(yīng)持續(xù)2min。過(guò)快拔出針頭可能會(huì)導(dǎo)致AAV病毒液漏出。
  注意：為避免??死亡，??不可暴露于低溫環(huán)境下超過(guò)30min。

6. 復(fù)蘇

• 注射結(jié)束后，將??做好標(biāo)記，放在已預(yù)熱好的?型加熱墊上使??體溫恢復(fù)正常。

7. 術(shù)后觀(guān)察

• 待??體溫恢復(fù)正常后，將??重新放回?籠中，由??繼續(xù)哺乳。觀(guān)察??的?存狀況直?后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

預(yù)期結(jié)果

?個(gè)成功的AAV體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)果如圖5所?。

圖5 ??使?以上的?法注射EGFP熒光AAV9， 劑量1x10¹³ GC/kg。注射后第?天，分離腦部進(jìn)?分析。海?區(qū)域圖像使? 熒光共聚焦顯微鏡拍攝。綠?：EGFP。藍(lán)?： DAPI。

為成功轉(zhuǎn)導(dǎo)超純化AAV到??組織，以下表格提供了針對(duì)不同注射?法的建議注射體積和劑量。

注意：AAV的在組織中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效果可以持續(xù)2-6個(gè)? ，并且通常在注射后2-4周可以達(dá)到表達(dá)峰值。但是除了注射劑量，其他因素可能也會(huì)影響AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)后的基因表達(dá)時(shí)?和峰值表達(dá)時(shí)間。