下表為定制化腺相關(guān)病毒產(chǎn)品的交付內(nèi)容?？稍谙鄳?yīng)COA（Certificate of analysis document）文件查看病毒滴度。

1. 腺相關(guān)病毒產(chǎn)品使用干冰冷藏運(yùn)輸。收到病毒后，可直接放置-80°C冷 凍保存至少1年，也可放置-20°C冷凍保存2-3周。

2. 使用前，將病毒液放置冰上進(jìn)行融解。實(shí)驗(yàn)過程中，亦需保持冰上放 置。融解后的腺相關(guān)病毒可放置4°C保存1-2周（在4°C條件下，腺相 關(guān)病毒比慢病毒相對(duì)穩(wěn)定，一般不會(huì)出現(xiàn)顯著的活性降低問題）。

3. 若實(shí)際用量較少，可將融解的腺相關(guān)病毒少量分裝多管，再放置-80°C冷凍保存。如果您需要對(duì)腺相關(guān)病毒進(jìn)行稀釋，請(qǐng)使用PBS現(xiàn)稀 釋現(xiàn)用。

注意： 應(yīng)避免反復(fù)凍融。腺相關(guān)病毒較之其他多種病毒更為穩(wěn)定，盡管反復(fù)凍融不會(huì)造成其活性顯著降低，但請(qǐng)盡量避免反復(fù)凍融。

所有VectorBuilder的腺相關(guān)病毒的基因組是由重組轉(zhuǎn)基因序列及其兩側(cè)的腺相關(guān)病毒反向末端重復(fù)序列（ITRs） 組成。 ITRs序列只占到了野生型腺相關(guān)病毒基因組序列的6% ，也是載體上唯一的腺相關(guān)病毒特異序列。幾乎所有病毒結(jié)構(gòu)基因都被 刪除掉，這使得該病毒不能自我復(fù)制，唯有依賴腺病毒反式輔助進(jìn)行復(fù)制。我們使用輔助質(zhì)粒表達(dá)病毒復(fù)制相關(guān)基因，而不 是腺病毒。通過將3個(gè)質(zhì)粒（1個(gè)攜帶順式ITR元件的質(zhì)粒，1個(gè)編碼腺相關(guān)病毒復(fù)制酶和衣殼蛋白的反式質(zhì)粒以及1個(gè)表達(dá)部分腺病毒基因的輔助質(zhì)粒）同時(shí)瞬轉(zhuǎn)293T細(xì)胞制備出腺相關(guān)病毒顆粒。這種方法可制備出不同的血清型腺相關(guān)病毒。 重組腺相關(guān)病毒是從對(duì)人體沒有致病性的野生型病毒改造而成。野生型腺相關(guān)病毒的復(fù)制依賴于腺病毒或者皰疹病毒，一旦 這些輔助病毒不存在，野生型病毒會(huì)穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中。重組腺相關(guān)病毒通常主要以游離的形式存在于靶細(xì)胞 中，整合效率極低。我們建議按照BSL-2規(guī)范（Biosafety Level-2 ，二級(jí)生物安全防護(hù)水平）對(duì)腺相關(guān)病毒進(jìn)行操作。所有 的操作、儲(chǔ)存以及生物廢料的處理均需依照公共機(jī)構(gòu)發(fā)布的和所處機(jī)構(gòu)制定的規(guī)范條例。

腺相關(guān)病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與細(xì)胞類型有關(guān)。有些細(xì)胞類型顯示較低的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而有些細(xì)胞類型則顯示較高的效率。在設(shè)計(jì)腺 相關(guān)病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)時(shí)，可使用表達(dá)綠色熒光蛋白的不同血清型的腺相關(guān)病毒來確定待轉(zhuǎn)導(dǎo)組織或者細(xì)胞的最適血清型。對(duì) 于不難感染的細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的初始MOI可在 1×10⁴ - 1×10⁶ genome copy（GC）之間。對(duì)于較難感染的細(xì)胞則需要更高 的MOI。一般來說，選擇那些轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高但細(xì)胞死亡率最低的MOI。而對(duì)某些細(xì)胞種類而言，無論怎么調(diào)整MOI ，也可能無法獲得較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)方法

1. 轉(zhuǎn)導(dǎo)前1天（第0天）

• 將一定數(shù)量靶細(xì)胞接種至一個(gè)新的培養(yǎng)皿中（轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)靶細(xì)胞的融合度應(yīng)為30%-50%）。放置37°C、 5% CO₂ 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-20個(gè)小時(shí)。例如，當(dāng)靶細(xì)胞為293T時(shí)，建議接種3×10⁵個(gè)細(xì)胞至6孔板的一個(gè)孔中。

2. 轉(zhuǎn)導(dǎo)當(dāng)天（第1天）

• 了吸取到準(zhǔn)確數(shù)量的病毒，請(qǐng)先輕柔吸打，混勻融解后的病毒顆粒，再取適量的病毒液至適量的培養(yǎng)基中，然后輕柔混 勻（避免渦旋震蕩）。為獲得較好的轉(zhuǎn)導(dǎo)效果，培養(yǎng)基用量盡可能少，以覆蓋培養(yǎng)皿表面為宜。一般來說，用量約100 ul/cm² 。例如，當(dāng)在6孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，建議1個(gè)孔使用1 ml培養(yǎng)基（ 6孔板一個(gè)孔的表面面積約10 cm²）。吸出原有培養(yǎng)基，然后向細(xì)胞中加入含有病毒的培養(yǎng)基。
• 輕柔地?fù)u動(dòng)培養(yǎng)板以使病毒液都能覆蓋每一處細(xì)胞。放置于37°C、5% CO₂ 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
• 注意：如果您擔(dān)心細(xì)胞暴露在病毒液中太久可能會(huì)影響細(xì)胞狀態(tài)，可以將轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間縮短在6-8小時(shí)。

3. 第2天

• 換液。吸出含有病毒的培養(yǎng)基，加入新鮮的完全培養(yǎng)基，放置于37°C、5% CO₂ 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

4. 第3天及之后

• 轉(zhuǎn)導(dǎo)后，需要在理想的時(shí)間點(diǎn)分析目的基因的表達(dá)情況。一般而言，轉(zhuǎn)導(dǎo)后24-48小時(shí)，目的基因明顯表達(dá)。
  注意：對(duì)于分裂活躍的細(xì)胞（如倍增時(shí)間約為24小時(shí)），轉(zhuǎn)導(dǎo)后24小時(shí)內(nèi)即可檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第48-96小 時(shí)（第2-4天）表達(dá)量達(dá)到最大，轉(zhuǎn)導(dǎo)5天后，表達(dá)水平通常會(huì)開始下降。對(duì)于分裂周期較長(zhǎng)或者無分裂行為的細(xì)胞，高水 平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)則通常會(huì)持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間。如果您是第一次使用重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，建議您先進(jìn)行時(shí)間摸索 實(shí)驗(yàn)，以確定目的基因的最佳表達(dá)時(shí)間。

成功轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)例

圖1所示為成功轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個(gè)實(shí)例。

圖1. 按照本文實(shí)驗(yàn)方案，使用表達(dá)綠色熒光蛋白的AAV2型腺相關(guān)病毒以MOI=10000轉(zhuǎn)導(dǎo)293T細(xì)胞。100×參數(shù)下拍照。左圖：明視野；右圖：綠色熒光。