我們的pUASTattB載體系統(tǒng)是一個(gè)高效的轉(zhuǎn)基因果蠅制備和基因表達(dá)控制系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用噬菌體φC31整合酶介導(dǎo)的重組實(shí)現(xiàn)靶向基因有效插入，并結(jié)合強(qiáng)大的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Gal4調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。pUASTattB載體系統(tǒng)類似于pUAST系統(tǒng)，然而它是利用φC31整合酶介導(dǎo)重組而不是基于P元件的轉(zhuǎn)座實(shí)現(xiàn)目的基因的插入。

噬菌體φC31整合酶能高效介導(dǎo)噬菌體附著位點(diǎn)（稱為attP）和細(xì)菌附著位點(diǎn)（稱為attB）之間的序列特異性重組。與基于轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)（如P元件介導(dǎo)的重組）相反，φC31介導(dǎo)的插入是不可逆的。pUASTattB整合到attP位點(diǎn)后會(huì)產(chǎn)生兩個(gè)新的位點(diǎn)（attL和attR），新的位點(diǎn)將不再被φC31整合酶識(shí)別。另外，基于φC31的插入是具有位點(diǎn)特異性的，通常僅在attP位點(diǎn)發(fā)生?；谶@個(gè)原因，pUASTattB載體系統(tǒng)通常用于攜帶attP“著陸位點(diǎn)”的果蠅系。

pUASTattB系統(tǒng)包含兩個(gè)載體，一個(gè)稱為pUASTattB載體或是攜帶attB位點(diǎn)和目的基因的φC31供體載體；另一個(gè)為編碼φC31整合酶的輔助載體。當(dāng)pUASTattB和φC31輔助質(zhì)粒共同注射到含有attP位點(diǎn)的細(xì)胞時(shí)，φC31整合酶介導(dǎo)attB和attP位點(diǎn)之間發(fā)生重組，導(dǎo)致pUASTattB載體線性化并整合到宿主基因組中。 mini white基因的表達(dá)，可以使果蠅的眼色發(fā)生變化，是鑒定轉(zhuǎn)基因果蠅成功與否的標(biāo)記。

將φC31整合酶引入果蠅宿主有多種方法，可以使用體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的φC31整合酶mRNA注射靶細(xì)胞，也可以將表達(dá)φC31整合酶的輔助質(zhì)粒與pUASTattB載體一起共注射到細(xì)胞中。此外，也可以利用φC31整合酶果蠅系實(shí)現(xiàn)基因的高效插入。

在pUASTattB系統(tǒng)中，目的基因?qū)⒈豢寺〉胶铣烧T導(dǎo)型啟動(dòng)子的下游，該啟動(dòng)子由5個(gè)串聯(lián)排列的GAL4結(jié)合位點(diǎn)（5xUAS）和hsp70 TATA box組成。目的基因依賴于GAL4的表達(dá)，GAL4蛋白在與pUAST質(zhì)粒上的UAS位點(diǎn)結(jié)合后會(huì)激活目的基因的轉(zhuǎn)錄。因此，在沒有GAL4表達(dá)的情況下，目的基因保持沉默，但是通過與表達(dá)GAL4的果蠅系雜交后，在GAL4表達(dá)的細(xì)胞中，目的基因會(huì)被轉(zhuǎn)錄激活。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請(qǐng)參考以下文獻(xiàn)。

我們的pUASTattB果蠅基因表達(dá)載體可有效實(shí)現(xiàn)φC31整合酶介導(dǎo)的基因插入或目的基因GAL4依賴性表達(dá)。我們的載體在大腸桿菌中具有高拷貝，可用于高效產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因果蠅。

特定位點(diǎn)插入：基于φC31的插入具有位點(diǎn)特異性，通常僅發(fā)生在attP位點(diǎn)，降低了破壞內(nèi)源基因或插入位點(diǎn)不當(dāng)影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)。

高水平表達(dá)：5×UAS/mini_Hsp70啟動(dòng)子可以在誘導(dǎo)狀態(tài)下使目的基因高水平表達(dá)。

選擇性表達(dá): 不存在GAL4的情況下，目的基因的轉(zhuǎn)錄水平很低或沒有；在GAL4的存在下，則能實(shí)現(xiàn)高水平的基因轉(zhuǎn)錄。

高效：使用φC31整合酶實(shí)現(xiàn)種系轉(zhuǎn)基因比基于P元件的載體系統(tǒng)如pUAST更有效。

潛在的泄漏表達(dá)：在某些情況下，即使沒有GAL4，目的基因也會(huì)發(fā)生低水平泄漏表達(dá)。

技術(shù)復(fù)雜：轉(zhuǎn)基因果蠅的產(chǎn)生需要胚胎注射和飛行飼養(yǎng)，具有一定的技術(shù)復(fù)雜性。

需要attP插入位點(diǎn)：使用pUASTattB載體系統(tǒng)制備轉(zhuǎn)基因果蠅，需要使用基因組中攜帶attP“著陸位點(diǎn)”的特異宿主。

5×UAS/mini_Hsp70: The Drosophila melanogaster heat shock protein 70 (Hsp70) minimal promoter fused with five tandem galactose upstream activating sequences (5×UAS). This is a strong promoter, tightly inducible by GAL4.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

SV40 terminator: Simian virus 40 transcriptional terminator. Contains the SV40 small T intron and the SV40 early polyadenylation signal.

attB site: The bacterial attachment site, attB, recognized by the bacteriophage φC31 serine integrase. φC31 integrase can catalyze site-specific integration of attB-containing plasmids into attP-containing docking or landing sites that have been introduced into host genomes.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

mini-white: A variant of the Drosophila white gene. The mini-white gene is a dominant marker for adult fruit fly eye color, which can be used as a reporter to identify transgenic events in a white mutant background.