我們的pUASTB載體系統(tǒng)是一個高效的轉(zhuǎn)基因果蠅制備和基因表達(dá)控制系統(tǒng)。該系統(tǒng)能夠利用果蠅P元件轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)（如pUAST）或噬菌體φC31整合系統(tǒng)（如pUASTattB）并結(jié)合強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動子Gal4調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。因此，pUASTB載體系統(tǒng)可用于P轉(zhuǎn)座子和φC31整合酶介導(dǎo)目的基因插入。目的基因會被克隆到pUASTB兩個P-元件末端重復(fù)序列中間和attB重組位點(diǎn)附近的區(qū)域。

為了實(shí)現(xiàn)P轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的插入，將pUASTB質(zhì)粒和表達(dá)P轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒共同導(dǎo)入宿主細(xì)胞或胚胎中。 接著，由輔助質(zhì)粒產(chǎn)生的轉(zhuǎn)座酶識別pUASTB質(zhì)粒上的兩個P元件末端重復(fù)序列，并將包含兩個P元件末端重復(fù)之間的序列插入宿主基因組中。

為了實(shí)現(xiàn)φC31整合酶介導(dǎo)的插入，將pUASTB質(zhì)粒和表達(dá)φC31整合酶的輔助質(zhì)粒共同導(dǎo)入宿主細(xì)胞或含有attP位點(diǎn)的胚胎中。φC31整合酶介導(dǎo)attB和attP位點(diǎn)之間的不可逆重組，導(dǎo)致pUASTB載體線性化并整合到宿主基因組中。

mini white基因的表達(dá)，可以使果蠅的眼色發(fā)生變化，是鑒定轉(zhuǎn)基因果蠅成功與否的標(biāo)記。

在pUASTB系統(tǒng)中，目的基因?qū)⒈豢寺〉胶铣烧T導(dǎo)型啟動子的下游，該啟動子由5個串聯(lián)排列的GAL4結(jié)合位點(diǎn)（5xUAS）和hsp70 TATA box組成。目的基因依賴于GAL4的表達(dá)，GAL4蛋白在與pUAST質(zhì)粒上的UAS位點(diǎn)結(jié)合后會激活目的基因的轉(zhuǎn)錄。因此，在沒有GAL4表達(dá)的情況下，目的基因保持沉默，但是通過與表達(dá)GAL4的果蠅系雜交后，在GAL4表達(dá)的細(xì)胞中，目的基因會被轉(zhuǎn)錄激活。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請參考以下文獻(xiàn)。

我們的pUAST果蠅基因表達(dá)載體可有效實(shí)現(xiàn)P轉(zhuǎn)座酶或φC31整合酶介導(dǎo)的基因插入或目的基因GAL4依賴性表達(dá)。我們的載體在大腸桿菌中具有高拷貝，可用于高效產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因果蠅。

特定位點(diǎn)插入：基于φC31的插入具有位點(diǎn)特異性，通常僅發(fā)生在attP位點(diǎn)，降低了破壞內(nèi)源基因或插入位點(diǎn)不當(dāng)影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)的風(fēng)險。

高水平表達(dá)：5×UAS/mini_Hsp70啟動子可以在誘導(dǎo)狀態(tài)下使目的基因高水平表達(dá)。

選擇性表達(dá): 不存在GAL4的情況下，目的基因的轉(zhuǎn)錄水平很低或沒有；在GAL4的存在下，則能實(shí)現(xiàn)高水平的基因轉(zhuǎn)錄。

高效：使用φC31整合酶實(shí)現(xiàn)種系轉(zhuǎn)基因比基于P元件的載體系統(tǒng)如pUAST更有效。

基因組隨機(jī)插入：p元件的隨機(jī)整合，使得插入位點(diǎn)難以定位，基因組位置也有可能影響轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。此外，轉(zhuǎn)基因插入到基因或基因組內(nèi)的調(diào)控元件可能影響內(nèi)源基因。

潛在的泄漏表達(dá)：在某些情況下，即使沒有GAL4，目的基因也會發(fā)生低水平泄漏表達(dá)。

技術(shù)復(fù)雜：轉(zhuǎn)基因果蠅的產(chǎn)生需要胚胎注射和飛行飼養(yǎng)，具有一定的技術(shù)復(fù)雜性。

需要attP插入位點(diǎn)：使用pUASTattB載體系統(tǒng)制備轉(zhuǎn)基因果蠅，需要使用基因組中攜帶attP“著陸位點(diǎn)”的特異宿主。

P-element 3’ end: Right terminal repeat, or 3' terminal repeat, of the P element. When a DNA sequence is flanked by the 3’ and 5’ P-element terminal repeats, the P transposase can recognize them and insert the flanked region into the host genome.

5×UAS/mini_Hsp70: The Drosophila melanogaster heat shock protein 70 (Hsp70) minimal promoter fused with five tandem galactose upstream activating sequences (5×UAS). This is a strong promoter, tightly inducible by GAL4.

Kozak: Drosophila Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

SV40 terminator: Simian virus 40 transcriptional terminator. Contains the SV40 small T intron and the SV40 early polyadenylation signal.

attB site: The bacterial attachment site, attB, recognized by the bacteriophage φC31 serine integrase. φC31 integrase can catalyze site-specific integration of attB-containing plasmids into attP-containing docking or landing sites that have been introduced into host genomes.

mini-white: A variant of the Drosophila white gene. The mini-white gene is a dominant marker for adult fruit fly eye color, which can be used as a reporter to identify transgenic events in a white mutant background.

P-element 5’ end: Left terminal repeat, or 5' terminal repeat, of the P element. When a DNA sequence is flanked by the 3’ and 5’ P-element terminal repeats, the P transposase can recognize them and insert the flanked region into the host genome.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.