在哺乳動物細胞和動物中，該常規(guī)質粒FLEX（Flip-Excision）條件性基因表達載體系統(tǒng)Cre-off，通過Cre重組酶條件性失活目的基因的表達。FLEX Cre-off系統(tǒng)利用位于目的基因兩側的Lox-變體重組位點，在Cre重組酶的調控下目的基因發(fā)生反轉，目的基因不能正常表達；而Cre不存在的情況下，目的基因則正常表達。

FLEX Cre-off系統(tǒng)由兩對異型Lox-變體重組位點組成，其中野生型序列稱為LoxP，突變體稱為Lox2272，分別位于ORF的兩側。 兩種Lox-變體都可被Cre識別，但只有相同的Lox位點對可以彼此重組，與其他Lox-變體不能進行重組。 LoxP和Lox2272位點以交替方式位于ORF兩端，每對位點互為反向。Cre重組酶不存在的情況下，客戶定制的啟動子可以驅動目的基因的正常表達。Cre重組酶存在的情況下，LoxP和Lox2272位點對分別重組，導致ORF方向反轉為反向，且其中的一對重組位點將具有相同的方向，Cre會介導產生正向重組切割，繼而分別留下一個不同的重組位點。ORF方向的反轉，使得目的基因無法正常表達。由于ORF側翼是兩個不同的Lox-變體位點，所以即使存在Cre也不會進一步發(fā)生重組。

雖然該載體系統(tǒng)可用于組織培養(yǎng)細胞，但它更適用于制備轉基因動物。 當攜帶這種載體的轉基因動物與攜帶組織特異性Cre的轉基因動物雜交時，在攜帶兩種載體的后代轉基因動物中，特別是在表達組織特異性Cre的細胞中，目的基因的表達將會失活。

抗性篩選或熒光基因可以添加到該載體中，以便于通過藥篩或者熒光篩選出永久整合外源基因的細胞。

關于該載體系統(tǒng)的更多信息，請參考以下文獻。

該載體用于在哺乳動物細胞和動物中，Cre介導的條件性基因表達。目的基因最初處于正常表達狀態(tài)，通過Cre重組酶的共表達后目的基因編碼方向發(fā)生反轉而實現(xiàn)永久失活。

基因失活可控：Cre重組酶存在的情況下，ORF方向轉為反向，可防止基因發(fā)生泄漏表達。

基因穩(wěn)定失活： 在Cre的存在下，LoxP和Lox2272位點對分別重組，導致ORF方向永久性地轉為反向，且其中的一對重組位點將具有相同的方向，Cre會介導產生正向重組切割，繼而在ORF的兩端留下兩個不同的Lox-變體，即使存在Cre也不會進一步發(fā)生重組，使得目的基因的表達永久失活。

技術簡單：常規(guī)轉染即可把質粒轉入細胞，相比起病毒載體需要進行病毒包裝，過程更簡單。

載體容量非常大：我們的載體總容量可達30 kb，其中質粒骨架只占3 kb，有足夠大的容量可以放置客戶所感興趣的序列。

高水平表達：常規(guī)質粒轉染細胞后，可以產生非常高的拷貝數(shù)（每個細胞多達幾千拷貝），使外源基因能高水平表達。

適用于動物體內研究：雖然該載體系統(tǒng)可用于組織培養(yǎng)細胞，但它更適用于制備Cre介導的條件性基因表達轉基因動物。

載體DNA非整合型：常規(guī)質粒在細胞里主要以游離DNA狀態(tài)存在，所以常規(guī)質粒轉染也稱為瞬時轉染。然而，質粒DNA也可以以非常低的概率永久整合到宿主基因組中（質粒轉染每102~106個細胞可能會有一個細胞的基因組被整合，整合效率取決于細胞類型）。如果將攜帶了藥物抗性基因或者熒光標記基因的載體轉到細胞中，在經過擴大和傳代培養(yǎng)后，可以使用藥物篩選或細胞分選來獲得穩(wěn)定整合了該載體的細胞。

可轉染的細胞類型受限：不同類型細胞的質粒轉染效率差異很大。非分裂細胞比分裂細胞更難轉染，原代細胞比永生化細胞系更難轉染。一些重要的細胞類型更是難以轉染，如神經元和胰島β細胞。另外，質粒轉染局限于體外細胞實驗，很少運用到活體實驗。

基因拷貝數(shù)在不同細胞中呈現(xiàn)差異性：盡管成功的轉染可以在單個細胞里產生非常高的拷貝數(shù)，但不同細胞間卻有高度的差異性。在一些細胞中，質?？截悢?shù)非常高，而在另外一些細胞卻是低拷貝甚至沒有。而病毒轉導更傾向于相對均勻地把基因轉到細胞中。

Promoter: The promoter driving your gene of interest is placed here.

Lox2272: Recombination site for Cre recombinase. Mutated Lox site with two base substitutions of wild type LoxP. Incompatible with LoxP sites. When Cre is present, the LoxP and LoxP2272 sites will be cut and recombine with compatible sites.

LoxP: Recombination site for Cre recombinase. Incompatible with Lox2272 sites. When Cre is present, the LoxP and Lox2272 sites will be cut and recombine with compatible sites.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here, in a sense orientation.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.