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mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體
概述
我們的體外轉(zhuǎn)錄載體是簡(jiǎn)單有效的RNA轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，適用于各種研究。通過(guò)mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體獲得的mRNA適用于體外翻譯、生物化學(xué)研究、注射入細(xì)胞或胚胎后的蛋白表達(dá)、以及特定序列的其他mRNA應(yīng)用。
該系統(tǒng)利用目的序列上游的T7啟動(dòng)子，通過(guò)T7噬菌體RNA聚合酶（T7 RNAP）和三磷酸核苷酸，在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下高效生成mRNA。我們建議您參考已發(fā)表文獻(xiàn)中經(jīng)測(cè)試的體外轉(zhuǎn)錄步驟說(shuō)明來(lái)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。
T7 RNAP對(duì)于有效的轉(zhuǎn)錄起始具有堿基要求，且這些堿基已經(jīng)被放置到載體上。T7啟動(dòng)子3'末端的前兩個(gè)堿基是GG，緊接著是客戶的目的序列。
我們的mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體會(huì)發(fā)生失控轉(zhuǎn)錄，這意味著T7 RNAP的轉(zhuǎn)錄能進(jìn)行到DNA模板的末端，不會(huì)在質(zhì)粒內(nèi)的任何特定位點(diǎn)終止。因此，在體外轉(zhuǎn)錄之前，應(yīng)通過(guò)使用SapI，BsiWI或AscI等限制性內(nèi)切酶來(lái)單酶切線性化環(huán)狀質(zhì)粒，以確保轉(zhuǎn)錄物的長(zhǎng)度和序列，這些單酶切位點(diǎn)緊鄰poly（A）序列的下游。值得注意的是，待轉(zhuǎn)錄的序列不能含有所用線性化酶切位點(diǎn)，以免產(chǎn)生截短的mRNA。不純的酶切產(chǎn)物可能會(huì)抑制隨后的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，因此建議通過(guò)柱子或酚氯仿來(lái)純化酶切產(chǎn)物。
在體內(nèi)應(yīng)用中，mRNA 5'末端添加7-甲基鳥(niǎo)苷帽對(duì)于RNA的穩(wěn)定、有效翻譯、核轉(zhuǎn)運(yùn)和剪接是非常必要的。對(duì)于大多數(shù)研究應(yīng)用而言，加帽的RNA也是必須的。RNA加帽可以通過(guò)使用帽子類(lèi)似物共轉(zhuǎn)錄或使用加帽酶轉(zhuǎn)錄后修飾。兩種方法都能產(chǎn)生適用于注射、體外翻譯和其他應(yīng)用的功能性加帽RNA。
關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請(qǐng)參考以下文獻(xiàn)。
| 參考文獻(xiàn) | 主題 |
|---|---|
| Nucleic Acids Res. 7:1931 (1979) | Cloning and characterization of the T7 promoter |
| Methods Mol Biol. 703:29 (2011) | Protocols for the synthesis of RNA by in vitro transcription |
| J Vis Exp. 61:3702 (2012) | ping, and transfection of mRNA |
| Protein Expr Purif. 9:142 (1997) | Protocol for expression and purification of T7 RNAP for in vitro transcription |
亮點(diǎn)
我們的mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體能高效用于T7 RNAP介導(dǎo)的體外轉(zhuǎn)錄。該載體在大腸桿菌中具有高拷貝復(fù)制能力，易于酶切，有助于大量生成mRNA。
優(yōu)勢(shì)
效率高：T7 RNAP是高效酶，其介導(dǎo)的體外轉(zhuǎn)錄可大量產(chǎn)生功能性RNA。
技術(shù)簡(jiǎn)單：操作簡(jiǎn)便，比在細(xì)胞中表達(dá)mRNA容易，且在細(xì)胞中表達(dá)mRNA還需要進(jìn)行轉(zhuǎn)染和細(xì)胞培養(yǎng)。
不足之處
方向特定：該載體系統(tǒng)只含有單個(gè)體外轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，如需要有義和反義轉(zhuǎn)錄物，則需要兩個(gè)載體。
失控轉(zhuǎn)錄：為了產(chǎn)生正確有效的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之前需要通過(guò)限制性內(nèi)切酶線性化質(zhì)粒模板。
載體關(guān)鍵元件
T7 promoter: A promoter for the RNA polymerase from T7 bacteriophage. Drives high-level transcription of the downstream sequence of interest.
Transcribed sequence: Your DNA sequence of interest to be transcribed into RNA is placed here.
poly(A): Thirty base poly(A) track. Adds stability to the transcribed mRNA.
SapI, BsiWI, AscI: Unique restriction endonuclease sites that can be used to linearize the plasmid prior to in vitro transcription.
pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.
Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.
