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載體指南
相關(guān)服務(wù)
載體構(gòu)建質(zhì)粒DNA制備
病毒包裝服務(wù)
mRNA基因遞送解決方案
CRISPR基因編輯解決方案
shRNA基因敲低解決方案
哺乳動物基因普通表達腺相關(guān)病毒載體
概述
腺相關(guān)病毒（AAV）載體系統(tǒng)是一種備受歡迎的體內(nèi)外基因傳遞系統(tǒng)，對哺乳動物多種類型細胞具有高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。不同于腺病毒，AAV的免疫原性極低，在體內(nèi)幾乎沒有致病性，使得AAV成為許多動物研究的理想工具。
AAV重組載體構(gòu)建完成后與輔助質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染進入包裝細胞。在包裝細胞中，位于兩個反向重復(fù)序列（ITRs）之間的DNA片段與輔助質(zhì)粒表達的病毒蛋白進一步包裝成病毒顆粒。
當病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細胞時，兩個ITR之間的外源DNA及病毒基因組一起進入細胞，線性雙鏈DNA基因組以游離DNA的形式存在于細胞核中。
在大多數(shù)情況下，可以在生物安全1級（BSL1）設(shè)施中處理AAV。AAV是復(fù)制缺陷型的、不會引起炎癥反應(yīng)和引發(fā)人類疾病。
人們已從自然界中鑒定出許多AAV病毒株，根據(jù)病毒表面衣殼蛋白的不同抗原將它們分成不同的血清型。不同血清型的病毒具有不同的組織嗜性（即感染組織特異性）。當我們的AAV載體使用不同的衣殼蛋白包裝病毒時，則會賦予病毒不同的血清型。AAV包裝時的ITR序列來源于AAV2，這是一種常用的AAV載體構(gòu)建方式，不影響血清型。另一方面，決定血清型的衣殼蛋白基因由Rep/Cap包裝質(zhì)粒編碼。下表列出了不同的AAV血清型及對應(yīng)的組織嗜性。
| 血清型 | 組織嗜性 |
|---|---|
| AAV1 | Smooth muscle, CNS, brain, lung, retina, inner ear, pancreas, heart, liver |
| AAV2 | Smooth muscle, CNS, brain, liver, pancreas, kidney, retina, inner ear, testes |
| AAV3 | Smooth muscle, liver, lung |
| AAV4 | CNS, retina, lung, kidney, heart |
| AAV5 | Smooth muscle, CNS, brain, lung, retina, heart |
| AAV6 | Smooth muscle, heart, lung, pancreas, adipose, liver |
| AAV6.2 | Lung, liver, inner ear |
| AAV7 | Smooth muscle, retina, CNS, brain, liver |
| AAV8 | Smooth muscle, CNS, brain, retina, inner ear, liver, pancreas, heart, kidney, adipose |
| AAV9 | Smooth muscle, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, inner ear, testes, kidney, adipose |
| AAV-rh10 | Smooth muscle, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, kidney |
| AAV-DJ | Liver, heart, kidney, spleen |
| AAV-DJ/8 | Liver, brain, spleen, kidney |
| AAV-PHP.eB | CNS |
| AAV-PHP.S | PNS |
| AAV2-retro | Spinal nerves |
| AAV2-QuadYF | Endothelial cell, retina |
| AAV2.7m8 | Retina, inner ear |
| 組織嗜性 | 推薦AAV血清型 |
|---|---|
| Smooth muscle | AAV1, AAV2, AAV3, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-rh10 |
| CNS | AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-rh10, AAV-PHP.eB |
| PNS | AAV-PHP.S |
| Brain | AAV1, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV-DJ/8 |
| Retina | AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-rh10, AAV2-QuadYF, AAV2.7m8 |
| Inner ear | AAV1, AAV2, AAV6.2, AAV8, AAV9, AAV2.7m8 |
| Lung | AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV9, AAV-rh10 |
| Liver | AAV1, AAV2, AAV3, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-rh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
| Pancreas | AAV1, AAV2, AAV6, AAV8, AAV9, AAV-rh10 |
| Heart | AAV1,AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAV-rh10, AAV-DJ |
| Kidney | AAV2, AAV4, AAV8, AAV9, AAV-rh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
| Adipose | AAV6, AAV8, AAV9 |
| Testes | AAV2, AAV9 |
| Spleen | AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
| Spinal nerves | AAV2-retro |
| Endothelial cells | AAV2-QuadYF |
關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請參考以下文獻。
| 參考文獻 | 主題 |
|---|---|
| Methods in Enzy. 507:229-54 (2012) | Review of AAV virology and uses |
| Curr Opin Pharmacol. 24:59-67 (2015) | AAV use in gene therapy, and serotype differences |
亮點
我們的AAV載體是經(jīng)過優(yōu)化的，可在大腸桿菌中進行高拷貝復(fù)制，是一個包裝病毒滴度高，細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，轉(zhuǎn)基因高水平表達的載體系統(tǒng)。該載體可用所有已知衣殼蛋白血清型的輔助質(zhì)粒進行包裝，包裝出來的病毒具有非常高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，且具有極高的生物安全性。
優(yōu)勢
安全性：AAV是可供選擇的最安全的病毒載體，它是復(fù)制缺陷的，不會引起任何人類疾病。
對宿主基因組造成破壞的低風(fēng)險性：在轉(zhuǎn)導(dǎo)進入靶細胞后，AAV病毒載體在細胞核保持著游離DNA的狀態(tài)，可以降低宿主基因組被破壞而致癌的風(fēng)險，使其成為人類體內(nèi)實驗的理想載體。
高病毒滴度：利用我們的AAV病毒載體可以包裝成高滴度的病毒。我們提供的病毒包裝服務(wù)病毒滴度可達到>1013 GC/ml。
宿主范圍廣：針對不同來源的常用哺乳動物（如人、小鼠和大鼠）細胞和組織，將我們的AAV載體包裝成對其具有親和性的血清型，可輕易實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)導(dǎo)。但是，某些類型的細胞仍然難以轉(zhuǎn)導(dǎo)（見下文不足之處），這與所用的血清型有關(guān)。
體內(nèi)外實驗均有效：我們的載體不僅能用于體內(nèi)活體動物實驗，還具有體外細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。
不足之處
載體容量?。?/strong>AAV是我們所有病毒載體系統(tǒng)中裝載量最小的。AAV的兩個ITR之間所能容納的最大序列長度是4.7 kb，允許使用者插入~4.2 kb的目的序列。
難以轉(zhuǎn)導(dǎo)特定類型的細胞：當利用合適的血清型進行包裝時，我們的AAV載體系統(tǒng)可以轉(zhuǎn)導(dǎo)很多不同類型的細胞，包括非分裂細胞。不同AAV血清型對不同類型的細胞具有不同的嗜性，針對某種特定類型的細胞需要特定血清型。
技術(shù)復(fù)雜：使用AAV病毒載體時，需要在包裝細胞中產(chǎn)生活病毒，然后測定病毒滴度。這些過程相對于常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，技術(shù)難度更高，周期更長。在訂購載體的同時，可以通過訂購我們的病毒包裝服務(wù)輕松解決這些問題。
載體關(guān)鍵元件
5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild type virus, 5' ITR and 3' ITR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome pointing in opposite directions, where they serve as the origin of viral genome replication.
Promoter: The promoter that drives your gene of interest is placed here.
Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.
ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.
Regulatory element: Allows the user to add the Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE). WPRE enhances virus stability in packaging cells, leading to higher titer of packaged virus; enhances higher expression of transgenes.
BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.
3' ITR: 3' inverted terminal repeat. See description for 5’ ITR.
Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.
pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.
Representative vector design
| VB ID | Vector name | Descriptions |
|---|---|---|
| VB010000-9394npt | pAAV[Exp]-CMV>EGFP:WPRE | A single-stranded AAV (ssAAV) mammalian gene expression vector encoding CMV-driven EGFP with a WPRE regulatory element. |
| VB231214-1622uat | pAAV[Exp]-CAG>hSMN1[NM_000344.4]:WPRE | A single-stranded AAV (ssAAV) vector expressing a human survival motor neuron gene SMN1, which is associated with SMA, driven by a CAG promoter with the regulatory element WPRE. |
