無腸腺病毒載體（又稱輔助依賴性腺病毒載體）是比前幾代腺病毒載體顯著改進(jìn)安全性的新一代腺病毒載體。這種載體上除了病毒復(fù)制和包裝所必需的順式作用元件外，幾乎不含任何病毒序列，使得無腸腺病毒載體在體內(nèi)使用時(shí)表現(xiàn)出極低的免疫原性和長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，在應(yīng)用于基因治療方面具有高度的有吸引力。此外，由于刪除了病毒編碼序列，該種載體的裝載容量可增加至37 kb，使其可以表達(dá)大尺寸或多個(gè)的轉(zhuǎn)基因。

由于無腸腺病毒載體缺乏所有病毒編碼序列，成功包裝重組病毒所需的病毒蛋白通過包裝時(shí)的輔助病毒提供。對(duì)于無腸腺病毒載體，包含用戶目的基因（GOI）的表達(dá)盒由啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，并且被克隆到兩個(gè)ITR（反向重復(fù)序列）之間。此外，該載體還加入了適當(dāng)長(zhǎng)度的填充序列，以保持兩個(gè)ITR之間的序列最終大小超過28 kb，這對(duì)于促進(jìn)病毒顆粒的高效包裝是必要的。包裝時(shí)，載體上的兩個(gè)ITR之前的區(qū)域通過限制性內(nèi)切酶消化從質(zhì)粒中釋放出來。釋放的片段被轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞中，這些細(xì)胞隨后通過轉(zhuǎn)導(dǎo)輔助病毒以產(chǎn)生重組腺病毒顆粒。

我們的無腸腺病毒載體系統(tǒng)需要利用到一個(gè)包裝信號(hào)位于兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間的輔助病毒，以及穩(wěn)定表達(dá)Cre重組酶的包裝細(xì)胞。在包裝細(xì)胞中這個(gè)輔助病毒基因組上的包裝信號(hào)發(fā)生Cre介導(dǎo)的切除，因此可以防止輔助病毒基因組與無腸腺病毒基因組一同被包裝進(jìn)病毒顆粒中。當(dāng)使用無腸腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞時(shí)，其DNA基因組被送入細(xì)胞中，并進(jìn)入細(xì)胞核以不整合宿主基因組的游離體DNA形式存在。在載體克隆過程中放置在兩個(gè)ITR之間的任何序列會(huì)被引入靶細(xì)胞。

關(guān)于該載體的更多信息，請(qǐng)參照以下的參考文獻(xiàn)。

我們的無腸腺病毒使用Ad5血清型。該種血清型的腺病毒已被證明具有高滴度、高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率以及良好的轉(zhuǎn)基因表達(dá)量。

高安全性：為了確保腺病毒載體的生物安全性，我們的無腸腺病毒載體缺失了病毒的編碼序列，只具有病毒復(fù)制和包裝所需的反式作用元件，因此相對(duì)于前代腺病毒載體具有更高的安全性。該種載體因此最小化了宿主免疫反應(yīng)，并且具有更長(zhǎng)的體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)間。

對(duì)宿主基因組造成破壞的低風(fēng)險(xiǎn)性：在轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入靶細(xì)胞后，腺病毒載體在細(xì)胞核保持著游離DNA的狀態(tài)，可以降低宿主基因組被破壞而致癌的風(fēng)險(xiǎn)，使其成為人類體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的理想載體。

高病毒滴度： 無腸腺病毒可通過再次轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞而得到大量擴(kuò)增，從而獲得超高滴度病毒，慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和AAV載體都不具有這個(gè)特性。我們提供的無腸腺病毒滴度可以達(dá)到>10¹⁰ IFU/ml。

組織嗜性廣： 來源于人、小鼠和大鼠等常用哺乳動(dòng)物細(xì)胞都能被腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，但某些細(xì)胞類型則比較難轉(zhuǎn)導(dǎo)（見下文不足之處）。

載體容量大： 無腸腺病毒載體由于刪除了病毒編碼序列，其裝載量可達(dá)37 kb，可以表達(dá)很大的或者多個(gè)轉(zhuǎn)基因。

體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均有效： 我們的載體不僅能用于體內(nèi)活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，還具有體外細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。

載體DNA非整合型：無腸腺病毒基因組不會(huì)整合到靶細(xì)胞的基因組中，而是以游離DNA的形式存在，并且隨著時(shí)間推移逐漸丟失，特別是在分裂細(xì)胞中。

難以轉(zhuǎn)導(dǎo)特定類型的細(xì)胞：雖然我們的無腸腺病毒可以轉(zhuǎn)導(dǎo)很多類型的細(xì)胞包括非分裂細(xì)胞，但對(duì)某些特定類型的細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、呼吸上皮分化細(xì)胞、外周血細(xì)胞、神經(jīng)元和造血干細(xì)胞等，卻無法進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

輔助病毒污染：我們的無腸腺病毒載體系統(tǒng)在包裝時(shí)需要利用一種包含floxed包裝信號(hào)的輔助病毒，以及穩(wěn)定表達(dá)Cre重組酶的包裝細(xì)胞。Cre重組酶可以介導(dǎo)輔助病毒包裝信號(hào)的切除，限制輔助病毒基因組無腸腺病毒基因組一同被包裝入病毒顆粒中。然而而，由于包裝信號(hào)切除效率的限制，重組病毒原液中可能仍存在低水平的輔助病毒成分污染。 

技術(shù)復(fù)雜：無腸腺病毒載體包裝時(shí)需要引入輔助病毒，相比普通腺病毒包裝技術(shù)難度更高。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat. In wild type virus, 5' ITR and 3' ITR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome pointing in opposite directions, where they serve as the origin of viral genome replication.

Ad5_E4 fragment: Adenovirus serotype 5 E4 gene promoter region. Can improve vector stability and supports packaging.

Promoter: The promoter that drives your gene of interest is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

hPGK promoter: Human phosphoglycerate kinase 1 gene promoter. It drives the ubiquitous expression the downstream marker gene.

Marker: A visually detectable gene (such as EGFP). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

TK pA: Herpes simplex virus thymidine kinase polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

C346_Stuffer: Part of C346 cosmid (GenBank L31948) DNA sequence. Used for maintaining a final size above 28 kb between the two ITRs of vectors to facilitate efficient packaging into virions.

HPRT_Stuffer: Part of human hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HPRT1) DNA sequence (containing introns 1, 2 and 3 and exon 2, 3). Used for maintaining a final size above 28 kb between the two ITRs of vectors to facilitate efficient packaging into virions.

Ψ: Adenovirus packaging signal required for the packaging of viral DNA into virus.

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. See description for 3’ ITR.

Kanamycin: Kanamycin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by kanamycin selection in E. coli.

pBR322 ori: pBR322 origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in medium copy numbers in E. coli.