FLEX條件性表達腺病毒載體結(jié)合了載體家的高效的腺病毒載體系統(tǒng)和Cre響應的FLEX條件性基因表達載體，可以幫助您實現(xiàn)在多種多樣的哺乳動物細胞中以腺病毒轉(zhuǎn)導Cre響應的FLEX基因表達調(diào)控開關(guān)。FLEX Cre-Switch系統(tǒng)的兩個Lox-變體重組位點之間包含一對反向平行的ORF，在Cre重組酶的調(diào)控下ORF上的兩個目的基因編碼方向反轉(zhuǎn)，從而讓一個目的基因從激活表達變成沉默，另一個目的基因從沉默變成激活表達。

FLEX Cre-switch系統(tǒng)由兩對異型Lox-變體重組位點組成，其中野生型序列稱為LoxP，突變體稱為Lox2272，分別位于兩個基因ORF的兩側(cè)。 兩個ORF相互反向，其中一個ORF具有正確的讀碼方向（相對于啟動子）。兩種Lox-變體都可被Cre識別，但只有相同的Lox位點對可以彼此重組，與其他Lox-變體不能進行重組。LoxP和Lox2272位點以交替方式位于兩個ORF兩端，每對位點互為反向。Cre重組酶不存在的情況時，第一個ORF由于其編碼方向與啟動子方向相同，可以在客戶定制的啟動子驅(qū)動下正常表達，而第二個ORF由于其方向相反則無法正常表達。在Cre的存在下，LoxP和Lox2272位點對分別重組，導致兩個ORF方向反轉(zhuǎn)，且其中的一對重組位點將具有相同的方向，Cre會介導產(chǎn)生正向重組切割，繼而分別留下一個不同的重組位點。 ORF方向的反轉(zhuǎn)，使得第二個OR可以在啟動子的驅(qū)動下正常表達，而第一個ORF將不表達。 由于ORF側(cè)翼是兩個不同的Lox-變體位點，所以即使存在Cre也不會進一步發(fā)生重組。

腺病毒載體首先是以質(zhì)粒的方式構(gòu)建并使用E. coli擴增，然后線性化后轉(zhuǎn)染進入包裝細胞。在包裝過程中，位于兩個反向重復序列（ITR）之間的DNA片段與由包裝細胞表達的病毒蛋白進一步包裝成病毒顆粒。對于上述的FLEX介導的Cre-Switch條件性表達腺病毒載體，F(xiàn)LEX Cre-Switch開關(guān)位于兩個ITR之間。當病毒轉(zhuǎn)導宿主細胞時，載體并以游離DNA的形式存在于細胞核中。

通過改造優(yōu)化，我們的腺病毒載體缺失了E1A、E1B和E3區(qū)，前兩者與病毒包裝相關(guān)（這兩個基因已被整合到包裝細胞的基因組中）。因此，運用我們的病毒載體包裝出來的病毒是復制缺陷型的（只能轉(zhuǎn)導靶細胞而不能自我復制），大大提高了生物安全性。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請參考以下文獻。

FLEX Cre-Switch條件性表達腺病毒載體專為在哺乳動物細胞中實現(xiàn)兩個ORF可切換的基因表達而設計。目的基因表達受到用戶自定義的啟動子調(diào)節(jié)，并在Cre重組酶共表達的情況下沉默一個目的基因，并激活另一個目的基因表達。

該載體由血清型5（Ad5）腺病毒衍生而來。經(jīng)優(yōu)化，該載體系統(tǒng)在大腸桿菌體內(nèi)具有很高的拷貝數(shù)，包裝的活病毒具有很高的滴度，對大多數(shù)宿主細胞具有高效的轉(zhuǎn)導能力，能有效地把載體整合到靶細胞基因組并實現(xiàn)外源基因的高水平表達。

基因激活失活可控：兩個ORF的方向彼此相反確保當表達正向方向的ORF時，反向的ORF被抑制，可防止基因發(fā)生泄漏表達。

對宿主基因組造成破壞的低風險性：在轉(zhuǎn)導進入靶細胞后，腺病毒載體在細胞核保持著游離DNA的狀態(tài)，可以降低宿主基因組被破壞而致癌的風險，使其成為人類體內(nèi)實驗的理想載體。

超高病毒滴度：腺病毒可通過再次轉(zhuǎn)導包裝細胞而得到大量擴增，從而獲得超高滴度病毒，慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和AAV載體都不具有這個特性。我們提供的腺病毒滴度可以達到>10¹² VP/ml。

載體容量非常大：腺病毒能有效包裝的基因組上限大小是~38.7 kb（從5' ITR到3' ITR）。在除去腺病毒包裝表達所需主要元件所占用的容量之后，我們的載體具有約~7.5 kb的裝載空間以容納目的DNA（例如啟動子，ORF和熒光標記）。相比起容量為6.4 kb的慢病毒表達載體，腺病毒載體容量更大，能滿絕大多數(shù)應用要求。

宿主范圍廣泛：來源于人、小鼠和大鼠等常用哺乳動物細胞都能被腺病毒載體轉(zhuǎn)導，但某些細胞類型則比較難轉(zhuǎn)導（見下文不足之處）。

體內(nèi)外實驗均有效：我們的載體不僅能用于體內(nèi)活體動物實驗，還具有體外細胞轉(zhuǎn)導能力。

安全性高：為了確保腺病毒載體的生物安全性，我們的腺病毒載體缺失了病毒包裝所必須的基因（這些基因被整合到包裝細胞的基因組）。 所以，利用我們的腺病毒載體包裝出來的病毒是復制缺陷型的，并且只有在包裝細胞中才具有復制能力。

載體DNA非整合型：腺病毒基因組不會整合到靶細胞的基因組中，而是以游離DNA的形式存在，并且隨著時間推移逐漸丟失，特別是在分裂細胞中。

難以轉(zhuǎn)導特定類型的細胞：雖然我們的腺病毒載體可以轉(zhuǎn)導很多類型的細胞包括非分裂細胞，但對某些特定類型的細胞如內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、呼吸上皮分化細胞、外周血細胞、神經(jīng)元和造血干細胞等，卻無法進行有效的轉(zhuǎn)導。

較強的免疫原性：活腺病毒會在動物體內(nèi)引起強烈的免疫反應，從而限制了其在體內(nèi)的某些應用。

技術(shù)復雜：使用腺病毒載體時，需要在包裝細胞中產(chǎn)生活病毒，然后測定病毒滴度。這些過程技術(shù)難度更高，周期更長。

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild type virus, 5' ITR and 3' ITR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome pointing in opposite directions, where they serve as the origin of viral genome replication.

Ψ: Adenovirus packaging signal required for the packaging of viral DNA into virus.

Promoter: The promoter driving your gene of interest is placed here.

Lox2272: Recombination site for Cre recombinase. Mutated Lox site with two base substitutions of wild type LoxP. Incompatible with LoxP sites. When Cre is present, the LoxP and LoxP2272 sites will be cut and recombine with compatible sites.

LoxP: Recombination site for Cre recombinase. Incompatible with Lox2272 sites. When Cre is present, the LoxP and Lox2272 sites will be cut and recombine with compatible sites.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF #1: The open reading frame of a gene of interest is placed here, in a sense orientation. This gene can be expressed without Cre-mediated recombination.

ORF #2: The open reading frame of a gene of interest is placed here, in an antisense orientation. This gene can only be expressed after Cre-mediated recombination.

TK pA: Herpes simplex virus thymidine kinase polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

ΔAd5: Portion of Ad5 genome between the two ITRs minus the E1A, E1B and E3 regions.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat.

pBR322 ori: pBR322 origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in medium copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

PacI: PacI restriction site (PacI is a rare cutter that cuts at TTAATTAA). The two PacI restriction sites on the vector can be used to linearize the vector and remove the vector backbone from the viral sequence, which is necessary for efficient packaging.