我們的pUAST載體系統(tǒng)是一個良好、高效的轉(zhuǎn)基因果蠅制備和基因表達控制系統(tǒng)。該系統(tǒng)來源于常用的果蠅P元件轉(zhuǎn)座子，結(jié)合強誘導(dǎo)型啟動子Gal4以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達。

完整的pUAST系統(tǒng)包含兩個載體，一個載體被稱為pUAST質(zhì)粒，包含兩個P元件末端重復(fù)，包括待轉(zhuǎn)座的區(qū)域或基因；另一個載體稱為輔助質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座酶質(zhì)粒，編碼P轉(zhuǎn)座酶。

當pUAST與轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染靶細胞時，輔助質(zhì)粒產(chǎn)生的轉(zhuǎn)座酶識別pUAST質(zhì)粒上的兩個P元件末端重復(fù)序列，然后將待轉(zhuǎn)座區(qū)和兩個P元件末端重復(fù)序列插入到宿主基因組中。

P元件屬于II類轉(zhuǎn)座子，通過“剪切—粘貼”的機制移動，從一個地方轉(zhuǎn)座到另一個地方，而不留下序列本身（恰好相反，I類轉(zhuǎn)座子是通過“復(fù)制—粘貼”的方式移動），在每一個插入位點都會產(chǎn)生一個8 bp的正向重復(fù)序列。

通過將pUAST和輔助質(zhì)粒共注射到果蠅早期胚胎中可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因果蠅。P轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)兩個P元件末端重復(fù)序列之間的重組導(dǎo)致生殖系重組交換，以致產(chǎn)生攜帶靶基因的轉(zhuǎn)基因后代。P轉(zhuǎn)座酶僅在短時間內(nèi)表達，并且隨著輔助質(zhì)粒的丟失，轉(zhuǎn)座子在宿主基因組中的整合便成為永久性的。pUAST載體上的 mini white基因的表達，可以使果蠅的眼色發(fā)生變化，是鑒定轉(zhuǎn)基因果蠅成功與否的標記。或者也可以使用 PCR或其他分子方法鑒定轉(zhuǎn)基因細胞或動物。

在pUAST系統(tǒng)中，目的基因?qū)⒈豢寺〉胶铣烧T導(dǎo)型啟動子的下游，該啟動子由5個串聯(lián)排列的GAL4結(jié)合位點（5xUAS）和hsp70 TATA box組成。目的基因依賴于GAL4的表達，GAL4蛋白在與pUAST質(zhì)粒上的UAS位點結(jié)合后會激活目的基因的轉(zhuǎn)錄。因此，在沒有GAL4表達的情況下，目的基因保持沉默，但是通過與表達GAL4的果蠅系雜交后，在GAL4表達的細胞中，目的基因會被轉(zhuǎn)錄激活。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請參考以下文獻。

我們的pUAST果蠅基因表達載體可有效實現(xiàn)P轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的基因插入或目的基因GAL4依賴性表達。我們的載體在大腸桿菌中具有高拷貝，可用于高效產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因果蠅。

高水平表達：5×UAS/mini_Hsp70啟動子可以在誘導(dǎo)狀態(tài)下使目的基因高水平表達。

選擇性表達: 不存在GAL4的情況下，目的基因的轉(zhuǎn)錄水平很低或沒有；在GAL4的存在下，則能實現(xiàn)高水平的基因轉(zhuǎn)錄。

基因組隨機插入：p元件的隨機整合，使得插入位點難以定位，基因組位置也有可能影響轉(zhuǎn)基因的表達。此外，轉(zhuǎn)基因插入到基因或基因組內(nèi)的調(diào)控元件可能影響內(nèi)源基因。

效率中等：使用P元件載體實現(xiàn)種系轉(zhuǎn)基因通常比φC31整合酶介導(dǎo)的系統(tǒng)（pUASTattB）效率低。

潛在的泄漏表達：在某些情況下，即使沒有GAL4，目的基因也會發(fā)生低水平泄漏表達。

技術(shù)復(fù)雜：轉(zhuǎn)基因果蠅的產(chǎn)生需要胚胎注射和飛行飼養(yǎng)，具有一定的技術(shù)復(fù)雜性。

P-element 3’ end: Right terminal repeat, or 3' terminal repeat, of the P element. When a DNA sequence is flanked by the 3’ and 5’ P-element terminal repeats, the P transposase can recognize them and insert the flanked region into the host genome.

5×UAS/mini_Hsp70: The Drosophila melanogaster heat shock protein 70 (Hsp70) minimal promoter fused with five tandem galactose upstream activating sequences (5×UAS). This is a strong promoter, tightly inducible by GAL4.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

SV40 terminator: Simian virus 40 transcriptional terminator. Contains the SV40 small T intron and the SV40 early polyadenylation signal.

mini-white: A variant of the Drosophila white gene. The mini-white gene is a dominant marker for adult fruit fly eye color, which can be used as a reporter to identify transgenic events in a white mutant background.

P-element 5’ end: Left terminal repeat, or 5' terminal repeat, of the P element. When a DNA sequence is flanked by the 3’ and 5’ P-element terminal repeats, the P transposase can recognize them and insert the flanked region into the host genome.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.