技術(shù)詳情

shRNA具有其特有的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在RNA干擾（RNAi）過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，可精準(zhǔn)降解mRNA。shRNA轉(zhuǎn)錄形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)后，可識別并降解靶mRNA。shRNA文庫是大規(guī)模功能缺失篩選的強(qiáng)大工具。根據(jù)您的研究需求，云舟生物提供多種形式的shRNA文庫，包括E. coli菌株、質(zhì)粒DNA和包裝好的病毒載體。這些文庫都會進(jìn)行NGS測序驗(yàn)證以確定文庫的質(zhì)量。

圖 1 云舟生物shRNA敲低慢病毒載體

圖 2. 慢病毒shRNA文庫介導(dǎo)的功能缺失篩選流程圖，摘自Acta Biochim Biophys Sin 44：103-112 (2012)

慢病毒shRNA文庫介導(dǎo)的基因篩選常規(guī)流程如圖2所示。首先，利用慢病毒shRNA文庫轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞，并通過慢病毒載體上攜帶的篩選標(biāo)記（例如藥物選擇或熒光標(biāo)記）來篩選成功轉(zhuǎn)導(dǎo)的陽性細(xì)胞。將陽性細(xì)胞分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，對實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行壓力選擇（如藥物處理或重復(fù)傳代），篩選出具有目的表型的細(xì)胞?；蚬δ芎Y選策略通常有三種類型：1）活力篩選，篩選出shRNA富集或銳減的活細(xì)胞; 2）報(bào)告基因篩選，篩選出報(bào)告基因的表達(dá)強(qiáng)度與shRNA的富集有關(guān)的細(xì)胞（如靶向調(diào)節(jié)報(bào)道基因表達(dá)shRNA）；3）行為篩選，篩選出shRNA與細(xì)胞侵襲、遷移等基因相關(guān)的細(xì)胞。相對于對照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞篩選完成后，通過sanger測序或NGS測序鑒定出富集或銳減的shRNA。通過下游功能研究，進(jìn)一步分析富集或消減的shRNA可能靶向的候選基因。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

圖3 shRNA均一性在人和小鼠精華基因小庫（針對PubMed Central上約2,000個最常被引用的基因）中的分布。shRNA讀長分布按NGS文庫大?。?,000萬reads）標(biāo)準(zhǔn)化，并以log2比例繪制。NGS測序深度為300x。