云舟生物專注于高度復雜的CRISPR文庫設計，以滿足各種大規(guī)模和小規(guī)模功能篩選的實驗需求。CRISPR文庫可以以E. coli菌株、質粒DNA或重組病毒的形式交付。我們使用下一代測序（NGS）全面驗證定制文庫，能讓您真正了解所購買文庫的組分和質量。
亮點
表1 文庫構建服務價格與周期
| 服務 | 簡述 | 價格（CNY） | 周期 |
|---|---|---|---|
| 設計文庫構建策略 | CRISPR載體骨架設計、gRNA序列設計 | 免費 | 1-4 天 |
| 文庫質?？寺。ò╫ligo合成和NGS驗證） | 見表2。 | ||
| 文庫的病毒包裝 | 點擊此處了解更多病毒包裝服務信息。文庫質粒的病毒病毒包裝價格是常規(guī)單質粒載體包裝的1.5倍。 | ||
| 功能篩選樣品的NGS測序分析 | 包括細胞樣品基因組的NGS文庫制備、lllumina測序（>500×覆蓋率）和數(shù)據(jù)分析。 | ￥ 2,240/樣本 | 3-5 周 |
CRISPR文庫是一種強大的工具，可用于針對特定通路、疾病、細胞對藥物治療的反應、發(fā)育過程、基因調控等編碼或非編碼區(qū)域的大規(guī)模或全基因組功能篩選。表3展示了常用的CRISPR篩選方法并進行了比較。
表3 CRISPR篩選方法比較
| 篩選策略 | 機制 | 靶向區(qū)域 | 應用 |
|---|---|---|---|
| CRISPR KO | 野生型Cas9或Cas9核酸內切酶切割DNA。當細胞試圖修復DNA斷裂時，會在靶位點引入隨機突變。 | 主要為編碼區(qū)域 | 主要用于編碼基因的功能篩選 |
| CRISPRa | 酶切活性失活的突變型Cas9（dCas9）融合轉錄激活因子（VP64），結合靶位點調控激活基因表達。 | 通常為啟動子區(qū)域或者其它非編碼調控區(qū)域 | 編碼基因的功能獲得型篩選、非編碼區(qū)域的調控功能篩選 |
| CRISPRi | 酶切活性失活的突變型Cas9（dCas9）融合轉錄抑制因子（KRAB），結合靶位點調控抑制基因表達。 | 通常為啟動子區(qū)域或者其它非編碼調控區(qū)域 | 編碼基因的功能缺失型篩選、非編碼區(qū)域的調控功能篩選 |
圖1 云舟生物CRISPR文庫的復雜度、覆蓋率和序列比對的一致性。來自于云舟生物構建的CRISPR文庫的數(shù)據(jù)以無偏好方式進行收集和分析。（A）文庫復雜度范圍從102到>105。（B）gRNA的覆蓋率和讀取的比對率均很高，表明我們的文庫具有出色的覆蓋率和低錯誤率。
圖2 包含7.7×104個gRNA的文庫的gRNA分布統(tǒng)計。gRNA read counts使用NGS庫大?。ㄒ磺freads）進行標準化，并以log2尺度繪制。NGS測序深度為300×。
如果您需要使用您的文庫質粒構建文庫，請按照外來物品接收指南將質粒寄送給我們。請嚴格按照我們的指南來進行裝運以免造成物品的任何延誤和損壞?？蛻籼峁┑乃胁牧暇杞?jīng)過QC檢測，每一份材料附加檢測費用。請注意，客戶提供物品接收并通過QC之后生產才正式開始。對于使用客戶文庫質粒構建的文庫，我們無法保證文庫的多樣性和均一性。
使用說明書
Pooled Lentivirus Libraries for In Vitro Screening
對于CRISPR介導的基因編輯，Cas9核酸酶通過特異性的gRNA作用至靶位點以產生DNA切割。在大多數(shù)情況下，為了實現(xiàn)簡單的基因敲除，可以將單個gRNA與Cas9共同使用以產生DSB，然后通過NHEJ進行低效率的DNA修復，從而導致序列發(fā)生永久性突變，比如產生基因的小片段插入或堿基缺失。這類突變的一部分會導致基因的閱讀框移碼、出現(xiàn)提前終止密碼子等，最終導致目的基因的功能喪失。
雙gRNA則一般用于結合Cas9(D10A)切口酶對靶位點的兩條反向DNA鏈進行切割。在這種方法中，切口酶將在兩條鏈上產生單鏈切割，每一條鏈上的切割位點通過兩條gRNA中的一條引導，然后在靶位點產生DSB。一般來說，這種方法減少潛在的脫靶效應，因為該種DSB的產生要求兩條gRNA同時靶向序列。
當使用Cas9(D10A)切口酶和外源供體 DNA 模板將特定的堿基（例如敲入）引入感興趣的基因時，也可以使用雙gRNA。在這種方法中，兩條反向的DNA鏈將被兩個gRNA靶向位于所需突變位點兩側的兩個位點，然后通過HDR途徑利用外源DNA供體模板來修復切除的序列。
對于典型的基因敲除篩選，CRISPR文庫可以使用兩種骨架進行構建，分別是單載體系統(tǒng)和雙載體系統(tǒng)。在單載體系統(tǒng)中，Cas9或Cas9變體與gRNA共表達，即兩者在同一骨架上；而在雙載體系統(tǒng)中，Cas9或Cas9變體和gRNA分別在不同的載體上表達；或是表達gRNA的載體導入穩(wěn)定表達Cas9的細胞系中。單載體系統(tǒng)的優(yōu)點是不需要兩種載體共轉染或轉導到細胞，而且可以在非Cas9穩(wěn)定表達的細胞系使用。但是，它的克隆效率和病毒包裝效率比雙載體系統(tǒng)低，通用性也較差。
我們使用的gRNA設計和評分使用了CRISPR文庫設計（CLD）中的規(guī)則 。簡而言之，對于每個物種，我們找出符合N(20)NGG規(guī)則的靶序列，把錯配堿基≤3的序列列為潛在的脫靶位點，計算出每個gRNA的脫靶分值，進而得出最終的gRNA特異性分值。gRNA特異性分值在0-100之間，分值越大靶向特異性越高。
請注意特異性分值只是一個參考值。實際的靶向效率和特異性可能會與預測的分值有偏差，低分值的gRNA也可能有較好的靶向效果。
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