CRISPR/Cas9系統(tǒng)是當今炙手可熱的基因編輯工具，可以通過NHEJ途徑敲除目的基因，或通過同源重組敲除、敲入或標記基因。此外，Cas9經(jīng)過改造成為沒有剪切活性的Cas9（dead Cas9， dCas9）后，還可以充當基因表達的可編程阻遏物，從而用于構建CRISPRi基因抑制表達系統(tǒng)。對于CRISPR基因編輯應用，我們提供傳統(tǒng)和非整合型兩種CRISPR慢病毒。對于CRISPRi基因抑制應用，我們提供的CRISPRi慢病毒套裝包含2種病毒：gRNA慢病毒和dCas9-KRAB-MeCP2慢病毒。
CRISPR（3+1）慢病毒套裝（整合/非整合慢病毒）
| 服務名稱 | 生產(chǎn)規(guī)格 | 交付內(nèi)容 | 套裝價格（CNY） | 周期 |
|---|---|---|---|---|
| CRISPR（3+1）慢病毒套裝制備 | 微量規(guī)格 |
| ￥4,580.00 | 10-19天 |
| 小規(guī)格 |
| ￥7,680.00 | ||
| 中規(guī)格 |
| ￥10,080.00 | ||
| 大規(guī)格 |
| ￥15,980.00 | ||
| 超純化中規(guī)格 |
| ￥19,580.00 | ||
| 超純化大規(guī)格 |
| ￥23,380.00 |
注意：以上價格和周期包含載體構建
CRISPRi（3+1）慢病毒套裝
| 服務名稱 | 生產(chǎn)規(guī)格 | 交付內(nèi)容 | 套裝價格（CNY） | 周期 |
|---|---|---|---|---|
| CRISPRi（3+1）慢病毒套裝制備 | 微量規(guī)格 |
| ￥4,580.00 | 10-19天 |
| 小規(guī)格 |
| ￥7,680.00 | ||
| 中規(guī)格 |
| ￥10,080.00 | ||
| 大規(guī)格 |
| ￥15,980.00 | ||
| 超純化中規(guī)格 |
| ￥19,580.00 | ||
| 超純化大規(guī)格 |
| ￥23,380.00 |
注意：以上價格和周期包含載體構建
當前我們提供慢病毒類型的CRISPR（3+1）和CRISPRi（3+1）套裝。這些CRISPR載體系統(tǒng)均經(jīng)過我們專門優(yōu)化，在大腸桿菌中具有高拷貝復制、可包裝產(chǎn)生高滴度病毒并且對于靶細胞具有可靠的轉導效率。
我們的CRISPR慢病毒載體能將CRISPR/Cas9系統(tǒng)整合進細胞基因組中，隨細胞分裂而分裂，實現(xiàn)Cas9和gRNA的長期穩(wěn)定表達。如果選擇非整合型慢病毒進行包裝，這種慢病毒轉導細胞后由于其突變的整合酶沒有功能，病毒DNA不插入細胞基因組并且以非復制型游離體存在于轉導細胞中，則轉導進細胞的Cas9和gRNA不能持續(xù)表達，有助于降低脫靶風險。
在CRISPRi系統(tǒng)中，dCas9是與KRAB和MeCP2阻遏域融合在一起的，具有強大的基因阻遏功能。與shRNA相比，CRISPRi系統(tǒng)可以沉默更多類型基因，如蛋白編碼基因、非編碼RNA、microRNA等。對于我們的CRISPRi慢病毒套裝，其gRNA慢病毒攜帶Puromycin抗性基因，而dCas9-KRAB-MeCP2慢病毒攜帶Hygromycin抗性基因。進行實驗時，使用Puromycin和Hygromycin兩種抗生素篩選轉導細胞。
暫無
為了測定慢病毒的滴度，我們使用系列稀釋的慢病毒轉導293T細胞，然后使用qPCR的方法來定量測定每個宿主細胞基因組（使用BMP2拷貝數(shù)作為內(nèi)參）中病毒基因組（使用WPRE拷貝數(shù)作為參照）整合的平均拷貝數(shù)。這種方法能夠測定病毒的功能滴度，精確地反映出具有感染能力的病毒顆粒的數(shù)量。另外，還有其他測定病毒滴度的方法，其中一種是對病毒基因組RNA直接進行RT-qPCR來測定，但這種方法會嚴重高估病毒的滴度（通常約10倍，有時高達100倍），因為它測量的是所有病毒的基因組，包括無活性的病毒顆粒。由于慢病毒本身的不穩(wěn)定性，如果病毒不儲存于-80℃或被反復凍融，都會使得無活性病毒顆粒增加。另一種方法是基于病毒載體上攜帶的熒光或藥物篩選標記的表達量來測定轉導細胞的數(shù)量。該方法可能會嚴重低估病毒滴度，因為熒光或藥物篩選標記可能由于沉默或其他原因未能在一些宿主細胞中被檢測到，而有的細胞可能會被多個病毒顆粒感染。
對于CRISPR介導的基因組編輯，Cas9核酸酶靶向位點特異性引導RNA（gRNA）的靶位點以產(chǎn)生DNA切割。在大多數(shù)情況下，為了產(chǎn)生簡單的基因敲除，可以將單個gRNA與Cas9一起使用以產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSB），并通過非同源末端連接（NHEJ）低效修復，導致永久突變 ，如在修復位點產(chǎn)生小插入或缺失。某些突變會產(chǎn)生移碼，終止密碼子提前出現(xiàn)等，從而導致目的基因功能缺失。如果基因組中兩個臨近的位點（如小于幾kb）同時作為靶向位點，使用雙gRNA可能會導致中間區(qū)域片段的缺失（即片段敲除）。
如果使用Cas9_D10A缺刻酶靶向單個靶位點的兩條相對鏈，則可以使用雙gRNA。缺刻酶將在兩條鏈上產(chǎn)生單鏈切割，兩條gRNA分別引導缺刻酶在對應的一條鏈上進行切割，從而引起靶位點處發(fā)生DSB。 通常情況下，這種方法可以減少CRISPR/Cas9的脫靶效應，因為需要兩個gRNA同時打靶才能產(chǎn)生DSB。
當使用Cas9_D10A缺刻酶和外源Donor DNA模板將特定堿基（例如敲入）引入目的基因時，也可以使用雙gRNA。兩個gRNA靶向位于所需突變位點側翼的兩條相對鏈，然后通過同源定向修復（HDR）的方法利用外源模板來修復被切除的序列。
| shRNA | CRISPRi | |
|---|---|---|
| 工作原理 | 基因敲除能通過short hairpin RNAs（shRNAs）實現(xiàn)。shRNA表達后，被加?成small interfering RNAs（siRNAs）。這些siRNA被運到RNA-induced silencing complex（RISC）那里。接著，siRNA的反向鏈與正向鏈解開，正向鏈被降解、丟棄，反向鏈繼續(xù)與RISC復合物結合，將有活性的RISC復合物引導?與反向鏈互補的mRNA。?旦反向鏈與mRNA完全互補結合，RISC復合物中的?個蛋白，argonaute，會剪切mRNA，從而抑制mRNA編碼的蛋?翻譯表達。 | CRISPR interference（CRISPRi）技術采?了?個nuclease-dead Cas9蛋白（dCas9）與轉錄抑制因?組成的融合蛋白，例如Kruppel-associated box（KRAB）轉錄抑制因子。在這個融合蛋白里，dCas9仍然保留與DNA結合的活性，但是失去了核酸酶活性。dCas9融合蛋?在?條guide RNA（gRNA）引導下，結合至目標基因的transcriptional start site（TSS）區(qū)域，從而阻遏該基因的轉錄。 |
| 目標分子 | 成熟mRNA | 基因的TSS區(qū)域 |
| 打靶事件發(fā)?位置 | 細胞質 | 細胞核 |
| 抑制基因種類 | mRNA編碼基因、胞質lncRNA | mRNA編碼基因（針對因轉錄本太短而不能設計出有效shRNA的基因，可選擇CRISPRi技術）、胞質lncRNA、核內(nèi)lncRNA |
| 脫靶?險 | RNAi存在2類脫靶：序列相關性和非序列相關性序列相關性脫靶：僅憑有限的部分堿基互補，siRNA就能引起非目標mRNA的沉默。取決于siRNA序列，?個siRNA可能抑制成百上千條轉錄本。非序列相關性脫靶：shRNA采?內(nèi)源miRNA通路實現(xiàn)基因敲除。當?量shRNA導?細胞后，它們使RNAi系統(tǒng)達到飽和，并與內(nèi)源miRNA競爭蛋白，例如Dicer、RISC和其它因子。由此，那些內(nèi)源miRNA介導的基因調控受到干擾，導致不可以預期的脫靶。 | 與shRNA相比，CRISPRi的脫靶機率超低。 |
| 可逆的基因抑制 | 如使?質粒載體或者合成的siRNA，基因沉默是可逆的。如使?整合型病毒載體（如：慢病毒載體）實現(xiàn)結構性表達shRNA，則沉默非可逆性。 | 如使?質粒載體或者合成的dCas9融合蛋白/gRNA，基因沉默是可逆的。如使?整合型病毒載體（如：慢病毒載體）實現(xiàn)結構性表達dCas9融合蛋白和gRNA，則沉默非可逆性。如沉默重要的基因，推薦使?TetOn誘導表達CRISPRi慢病毒載體，可通過藥物控制這些基因的沉默。 |
我們使用的gRNA設計和評分規(guī)則與張峰實驗室開發(fā)的運算規(guī)則類似。簡而言之，對于每個物種，我們找出符合N(20)NGG規(guī)則的靶序列，把錯配堿基 ≤3的序列列為潛在的脫靶位點，計算出每個gRNA的脫靶分值，進而得出最終的gRNA特異性分值。gRNA特異性分值在0-100之間，分值越大靶向特異性越高。
請注意特異性分值只是一個參考值。實際的靶向效率和特異性可能會與預測的分值有偏差，低分值的gRNA也可能有較好的靶向效果。
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