圖4所示為使用Dual-gRNA慢病毒文庫(kù)進(jìn)行基因篩選的工作流程。首先，用慢病毒文庫(kù)轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)Cas9的目的細(xì)胞，通過(guò)慢病毒載體上攜帶的標(biāo)記基因篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞（如藥篩基因或者熒光標(biāo)記基因）。接著，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞分成兩群細(xì)胞：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。然后，對(duì)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行特定選擇壓力實(shí)驗(yàn)（如藥物處理或者重復(fù)傳代）來(lái)篩選出具有理想表型的細(xì)胞。在這個(gè)環(huán)節(jié)，通常有三種常用的篩選策略：1）細(xì)胞活性篩選：篩選出在選擇壓力下gRNA富集或者丟失的存活細(xì)胞；2）報(bào)告基因表達(dá)篩選：篩選出報(bào)告基因表達(dá)變強(qiáng)或變低同時(shí)gRNA富集或者丟失的細(xì)胞（如，gRNA打靶調(diào)控報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄因子）; 3）細(xì)胞行為篩選：篩選出與細(xì)胞入侵、遷移等行為基因相關(guān)gRNA。篩選后，收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，使用Sanger測(cè)序或者二代測(cè)序（NGS）鑒定出在實(shí)驗(yàn)組（相對(duì)于對(duì)照組）中變多了或者變少了的gRNA。最后，可通過(guò)下游功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究那些理論上被富集或者丟失的gRNA打靶的基因。