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產品特點

CRISPRi慢病毒
  • CRISPRi（CRISPR interference）慢病毒套裝包含2種病毒：gRNA慢病毒和dCas9-Silencer2慢病毒。1個gRNA慢病毒同時攜帶gRNA表達盒子和Puromycin抗性基因。1個dCas9-Silencer2慢病毒同時攜帶dCas9-Silencer2表達盒子和Hygromycin抗性基因。病毒感染細胞后，病毒基因組整合到細胞基因組中，隨細胞分裂而復制，實現外源基因長期穩(wěn)定表達。gRNA和dCas9-Silencer2融合蛋白需同時存在，CRISPRi才能工作。使用Puromycin和Hygromycin兩種抗生素篩選出成功感染2種病毒的細胞進行下游實驗。
  • dCas9（dead Cas9）是Cas9的突變體，缺失了核酸內切酶的能力。一旦表達，dCas9蛋白和gRNA將形成一個核糖核蛋白復合物（Ribonucleoprotein complex）。dCas9-gRNA復合體將任意地結合細胞基因組上的PAM序列（SpCas9的PAM序列為5'-NGG-3'），但只有gRNA分子的5‘引導序列（Guide sequence，約20 bp）與細胞基因組DNA配對時，dCas9才會充分解開靶序列的上下鏈，gRNA進一步與靶序列的其中一條鏈完全互補結合，此時，dCas9-gRNA復合體穩(wěn)定地結合到靶序列上。CRISPRi系統中，一般將gRNA設計為靶向一個基因的TSS（transcription start site）位置（-50到+300區(qū)域為佳）。在此位置，dCas9-gRNA復合體本身就能物理性地阻礙RNA聚合酶的作用，從而影響基因的表達。dCas9-Silencer2是一個dCas9融合了KRAB等轉錄抑制子的融合蛋白。KRAB等轉錄抑制子能進一步抑制基因的表達。Silencer2版本的轉錄抑制子，在KRAB的基礎上進行了優(yōu)化，抑制效率更高。
  • 多條gRNA作用一個基因的TSS區(qū)域，抑制效果更佳。

與shRNA相比，CRISPRi基因抑制更特異

shRNACRISPRi
工作原理基因敲除能通過short hairpin RNAs（shRNAs）實現。shRNA表達后，被加?成small interfering RNAs（siRNAs）。這些siRNA被運到RNA-induced silencing complex（RISC）那里。接著，siRNA的反向鏈與正向鏈解開，正向鏈被降解、丟棄，反向鏈繼續(xù)與RISC復合物結合，將有活性的RISC復合物引導?與反向鏈互補的mRNA。?旦反向鏈與mRNA完全互補結合，RISC復合物中的?個蛋白，argonaute，會剪切mRNA，從而抑制mRNA編碼的蛋?翻譯表達。CRISPR interference（CRISPRi）技術采?了?個nuclease-dead Cas9蛋白（dCas9）與轉錄抑制因?組成的融合蛋白，例如Kruppel-associated box（KRAB）轉錄抑制因子。在這個融合蛋白里，dCas9仍然保留與DNA結合的活性，但是失去了核酸酶活性。dCas9融合蛋?在?條guide RNA（gRNA）引導下，結合至目標基因的transcriptional start site（TSS）區(qū)域，從而阻遏該基因的轉錄。
目標分子成熟mRNA基因的TSS區(qū)域
打靶事件發(fā)?位置細胞質細胞核
抑制基因種類mRNA編碼基因、胞質lncRNAmRNA編碼基因（針對因轉錄本太短而不能設計出有效shRNA的基因，可選擇CRISPRi技術）、胞質lncRNA、核內lncRNA
脫靶?險

RNAi存在2類脫靶：序列相關性和非序列相關性

序列相關性脫靶：
僅憑有限的部分堿基互補，siRNA就能引起非目標mRNA的沉默。
取決于siRNA序列，?個siRNA可能抑制成百上千條轉錄本。

非序列相關性脫靶：
shRNA采?內源miRNA通路實現基因敲除。當?量shRNA導?細胞后，它們使RNAi系統達到飽和，并與內源miRNA競爭蛋白，例如Dicer、RISC和其它因子。由此，那些內源miRNA介導的基因調控受到干擾，導致不可以預期的脫靶。

與shRNA相比，CRISPRi的脫靶機率超低。
可逆的基因抑制如使?質粒載體或者合成的siRNA，基因沉默是可逆的。如使?整合型病毒載體（如：慢病毒載體）實現結構性表達shRNA，則沉默非可逆性。如使?質粒載體或者合成的dCas9融合蛋白/gRNA，基因沉默是可逆的。如使?整合型病毒載體（如：慢病毒載體）實現結構性表達dCas9融合蛋白和gRNA，則沉默非可逆性。如沉默重要的基因，推薦使?TetOn誘導表達CRISPRi慢病毒載體，可通過藥物控制這些基因的沉默。

產品規(guī)格

產品/服務規(guī)格交付內容貨號價格（￥）
CRISPRi慢病毒載體3件裝-3個定制gRNA慢病毒載體3Ecoli(LVgRNAi)￥1,780
CRISPRi慢病毒3+1套裝小規(guī)格包裝

3個定制gRNA慢病毒，每個定制病毒：>108 TU/ml，10x25 ul
1個dCas9-Silencer2輔助慢病毒：>108 TU/ml，3x100 ul

3LVS(LVgRNAi)-H¥5,400
中規(guī)格包裝

3個定制gRNA慢病毒，每個定制病毒：＞108 TU/ml，10x100 ul
1個dCas9-Silencer2輔助慢病毒：>108 TU/ml，10x100 ul

3LVM(LVgRNAi)-H¥7,700
中規(guī)格包裝和超純化

3個超純化定制gRNA慢病毒，每個定制病毒：＞109 TU/ml，10x50 ul
1個超純化dCas9-Silencer2輔助慢病毒：>109 TU/ml，10x50 ul

3LVMP(LVgRNAi)-H¥15,400
大規(guī)格包裝和超純化

3個超純化定制gRNA慢病毒，每個定制病毒：＞109 TU/ml，10x100 ul
1個超純化dCas9-Silencer2輔助慢病毒：>109 TU/ml，10x100 ul

3LVLP(LVgRNAi)-H¥19,300
Puromycin抗生素溶液-10 mg/ml，200 ul，溶于HEPES緩沖液，無菌C002S¥200
Hygromycin抗生素溶液-100 mg/ml，200 ul，溶于HEPES緩沖液，無菌C003S¥200

如需幫助，請致電020-28069042或者電郵service@vectorbuilder.cn

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