痘苗病毒（Vaccinia virus, VACV）作為基因遞送載體擁有多個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)，包括極大的裝載能力（25-30 kb）、廣泛的組織嗜性以及不依賴宿主組分的即可自我復(fù)制的能力。VACV近來在已體現(xiàn)出巨大的臨床應(yīng)用前景，包括疫苗開發(fā)和溶瘤治療。云舟生物當(dāng)前可提供VACV載體克隆和病毒包裝服務(wù)，適用于體外或體內(nèi)研究。
服務(wù)詳情
服務(wù)類型
我們提供的VACV載體構(gòu)建和病毒包裝服務(wù)如下：
- 使用VACV BACYAC骨架克隆的VACV載體，包括WR毒株和MVA毒株
- VACV病毒包裝
VACV載體克隆
云舟生物自主研發(fā)的“BACYAC”骨架專門為VACV載體克隆而設(shè)計(jì)。該骨架整合了細(xì)菌人工染色體（BAC）和酵母人工染色體（YAC）的關(guān)鍵元件。BAC相關(guān)元件允許該載體可以在大腸桿菌中以BAC形式擴(kuò)增，而YAC相關(guān)元件允許該載體在釀酒酵母中復(fù)制BACYAC載體因此可靈活地在大腸桿菌系統(tǒng)和酵母系統(tǒng)中進(jìn)行載體擴(kuò)增和序列修飾。
EGFP/LacZ報(bào)告基因、BACYAC骨架序列、以及痘苗病毒啟動(dòng)子被克隆到J2R位點(diǎn)之間的TK（胸苷激酶）基因中，以獲得減毒重組載體。我們的減毒W(wǎng)R毒株和MAV毒株可以被應(yīng)用于基礎(chǔ)科研、臨床前試驗(yàn)、臨床研究等領(lǐng)域。通過進(jìn)一步直接突變改造，我們還可以提供減毒程度更高的痘苗病毒。
VACV BACYAC載體的基本設(shè)計(jì)如圖1所示。
圖1 含有EGFP或LacZ報(bào)告基因的VACV BACYAC骨架
TK：胸苷激酶基因，在重組VACV中失活以產(chǎn)生減毒病毒。
p7.5：痘苗病毒啟動(dòng)子。VACV在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制需要痘苗病毒啟動(dòng)子。 p7.5 通常用于驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)，因?yàn)樗诓《緩?fù)制的早期和晚期具有轉(zhuǎn)錄活性。
LoxP：Cre重組酶作用的重組位點(diǎn)。兩個(gè)LoxP之間的序列可以被Cre重組酶剪切下來。
ITR：痘苗病毒基因組兩端的反向重復(fù)序列，帶有VGF基因。
N2：N2基因在病毒早期感染時(shí)表達(dá)，抑制宿主免疫過程。
M1：M1基因可防止宿主細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)病毒生產(chǎn)。
報(bào)告基因：由啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的EGFP和LacZ報(bào)告基因，用于識(shí)別轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。
BACYAC骨架：整合了細(xì)菌人工染色體（BAC）和酵母人工染色體（YAC）的載體骨架，可以在大腸桿菌種攜帶氯霉素抗性基因選擇性擴(kuò)增，也可以在釀酒酵母中使用His3自噬選擇標(biāo)記進(jìn)行擴(kuò)增。
VACV病毒包裝
價(jià)格與周期
| 規(guī)格 | 應(yīng)用 | 滴度 | 體積 | 價(jià)格 (CNY) | 周期 |
|---|
| VACV病毒小量制備 | 細(xì)胞培養(yǎng) | >108 PFU/ml | 250 ul (10x25 ul) | ￥2,880 | 21-28天 |
| VACV病毒中量制備 | >108 PFU/ml | 1 ml (10x100 ul) | ￥11,880 | 21-28天 |
| 超純化VACV病毒中量制備 | 細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)應(yīng)用 | >108 PFU/ml | ￥18,880 | 21-35天 |
運(yùn)輸與存儲(chǔ)
我們的VACV病毒保存于HBSS緩沖液，并以干冰形式運(yùn)輸。接收到病毒后，VACV可以在-80°C長(zhǎng)期存儲(chǔ)（可至少穩(wěn)定存儲(chǔ)6個(gè)月），或者在-20°C存儲(chǔ)一周。VACV的保質(zhì)期約為1年。請(qǐng)避免反復(fù)凍融VACV以避免顯著的滴度下降。
VACV制備與質(zhì)量控制
VACV包裝流程如圖2所示。攜帶目的基因的非感染性VACA BACYAC載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)非復(fù)制型的雞痘病毒作為輔助病毒。由于VACV具有廣泛的組織嗜性，因此可用多種類型的細(xì)胞包裝生產(chǎn)VACV。云舟生物首先采用多種類型的細(xì)胞用于VACV的復(fù)蘇和擴(kuò)增。我們使用嗜斑純化法初步獲得病毒克隆，然后進(jìn)行病毒擴(kuò)增。細(xì)胞外包膜病毒 (EEV) 和細(xì)胞內(nèi)成熟病毒 (IMV) 可以分別從上清液和細(xì)胞裂解液中收獲。EEV通過PEG濃縮后，與IMV的病毒液合并。對(duì)于超純化VACV，病毒顆粒經(jīng)過進(jìn)一步的蔗糖密度梯度離心以獲得純化和濃縮。
圖2 典型的VACV包裝流程。
對(duì)于每一個(gè)生產(chǎn)的重組VACV病毒，質(zhì)量控制包括滴度檢測(cè)、無菌測(cè)試、支原體檢測(cè)等。如果VACV病毒載體表達(dá)熒光蛋白，則我們會(huì)進(jìn)行熒光轉(zhuǎn)導(dǎo)測(cè)試。如果VACV病毒載體含有藥篩標(biāo)記，我們也會(huì)在轉(zhuǎn)導(dǎo)測(cè)試后伴隨進(jìn)行藥篩測(cè)試。此外，對(duì)于超純化VACV，我們會(huì)進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)。
試驗(yàn)驗(yàn)證
我們的VACV載體經(jīng)詳盡驗(yàn)證可以穩(wěn)定用于生產(chǎn)活病毒。 圖3顯示了經(jīng)我們性能驗(yàn)證的VACV病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK21細(xì)胞的效果。
Before transductionAfter transduction
圖3 表達(dá)EGFP的VACV轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK21細(xì)胞，MOI=0.5。轉(zhuǎn)導(dǎo)后0小時(shí)和72小時(shí)使用熒光顯微鏡成像。放大倍數(shù)：100×。左：明場(chǎng)。右：EGFP。
VACV背景知識(shí)
VACV是一種雙鏈線性DNA病毒，屬于痘病毒家族。它的基因組長(zhǎng)度約為190 kb，可以插入大型轉(zhuǎn)基因（25-30 kb）。VACV的基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄完全發(fā)生在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，病毒基因組編碼DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄所需的所有蛋白質(zhì)。因此，VACV的病毒生命周期對(duì)宿主細(xì)胞機(jī)制的依賴非常小。
在病毒生命周期的早期階段，會(huì)產(chǎn)生許多免疫調(diào)節(jié)蛋白，幫助病毒從宿主的病毒防御機(jī)制中逃脫。成熟的VACV主要有兩種形式：在細(xì)胞裂解時(shí)釋放的細(xì)胞內(nèi)成熟病毒 (IMV) 和通過胞吐作用釋放的細(xì)胞外包膜病毒 (EEV)。這兩種形式都能夠通過病毒脂質(zhì)膜與宿主細(xì)胞膜的融合來感染宿主細(xì)胞，而無需與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合以進(jìn)行感染。
VACV載體的主要應(yīng)用
重組VACV載體對(duì)于基因治療是一個(gè)富有前景的應(yīng)用工具，它具有許多優(yōu)點(diǎn)，比如良好的安全性、能夠容納很大的轉(zhuǎn)基因、可以感染多種類型的宿主細(xì)胞、可以在增強(qiáng)宿主免疫反應(yīng)的同時(shí)避免被宿主免疫系統(tǒng)靶向清除。
在痘病毒家族中，已經(jīng)開發(fā)出具有不同感染性能和復(fù)制能力的多種毒株，這會(huì)影響它們?cè)谂R床應(yīng)用中的實(shí)際使用。兩種非常常見的毒株是WR毒株和MVA毒株。雖然MVA由于其減毒特性而更常用于臨床場(chǎng)景，但WR的優(yōu)勢(shì)在于具有更高的復(fù)制效率并且可以更大程度地調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)。這兩種毒株目前均被廣泛用于科研和臨床研究。以下是應(yīng)用了VACV的一些主要研究方向：
腫瘤治療
除了直接裂解腫瘤細(xì)胞，VACV還可以通過招募免疫細(xì)胞使其分泌細(xì)胞因子來改變腫瘤微環(huán)境，從而引發(fā)非直接的抗腫瘤免疫反應(yīng)。為了保持VACV這種天然的優(yōu)點(diǎn)并增強(qiáng)其安全性，重組VACV進(jìn)行了特定的基因修飾。以Pexa-Vac溶瘤VACV為例，其減毒特性是通過刪除病毒TK基因?qū)崿F(xiàn)的，并且該病毒還表達(dá)GM-CSF轉(zhuǎn)基因以增強(qiáng)宿主免疫反應(yīng)。該病毒已經(jīng)用于治療多種實(shí)體瘤的臨床探索。當(dāng)前還存在其它幾種溶瘤VACV的臨床試驗(yàn)，可見VACV作為一種溶瘤治療工具正在快速發(fā)展。
疫苗制備
VACV作為外源抗原遞送系統(tǒng)也相當(dāng)有效。VACV可以包裝極大的DNA、作為天花疫苗具有很長(zhǎng)的應(yīng)用歷史，這些特性使其有利于成為對(duì)抗多種疾病的有力疫苗載體，比如針對(duì)HIV和狂犬病。
VACV載體的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)
廣泛的組織嗜性：VACV不具有用于感染特定細(xì)胞的表面蛋白，而是通過膜融合的方式感染細(xì)胞，使其可以侵入各種類型的包括分裂與非分裂細(xì)胞。
不整合宿主基因組：VACV的短生命周期只有8小時(shí)，且病毒復(fù)制全程在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，不具有病毒基因插入宿主基因組的風(fēng)險(xiǎn)。
腫瘤細(xì)胞中高復(fù)制效率：VACV在腫瘤細(xì)胞中可以選擇性地高效率復(fù)制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞裂解。
病毒復(fù)制機(jī)制獨(dú)立：VACV的mRNA轉(zhuǎn)錄極少依賴宿主細(xì)胞的組分，使其可以適應(yīng)不同類型的宿主細(xì)胞。
宿主免疫逃避：VACV具備逃避免疫系統(tǒng)攻擊的能力，方式包括產(chǎn)生補(bǔ)體控制蛋白結(jié)合并抑制宿主白細(xì)胞，以及利用宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜組分作為病毒的外包膜。因此VACV可以用于不同方式的注射方法從遠(yuǎn)端遞送至靶組織或腫瘤位點(diǎn)。
極大的裝載量：VACV具有很大的基因組，可以容納的30 kb的外源基因。
高滴度且高感染性：VACV可以包裝產(chǎn)生很高的滴度，同時(shí)具有良好的感染性，只需要很低的MOI即可成功轉(zhuǎn)導(dǎo)。
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使用說明書
VACV for In Vitro Applications
常見問題解答
VACV作為病毒載體具有一系列顯著的優(yōu)點(diǎn)：極大的裝載量、可以轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂與非分裂細(xì)胞、可以逃避宿主免疫系統(tǒng)、只在宿主細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制而不整合宿主基因組、以及病毒復(fù)制不依賴宿主細(xì)胞組分等。下表對(duì)比了VACV與其它幾種病毒載體：
| 慢病毒 | MMLV | 腺病毒 | AAV | VACV |
|---|
| 組織嗜性 | 廣泛 | 廣泛 | 對(duì)某些細(xì)胞難以感染 | 取決于血清型 | 廣泛 |
| 裝載容量 | 6.4 kb | 5.5 kb | 7.5 kb | 4.2 kb | 25-30 kb |
| 是否感染非分裂細(xì)胞 | 是 | 否 | 是 | 是 | 是 |
| 穩(wěn)定整合還是瞬時(shí)表達(dá) | 穩(wěn)定整合 | 穩(wěn)定整合 | 游離體DNA形式瞬時(shí)表達(dá) | 游離體DNA形式瞬時(shí)表達(dá) | 游離體DNA形式瞬時(shí)表達(dá) |
| 最高滴度 | 高 | 中等 | 非常高 | 高 | 高 |
| 是否可以自定義啟動(dòng)子 | 是 | 否 | 是 | 是 | 否 |
| 主要應(yīng)用 | 細(xì)胞培養(yǎng)與體內(nèi)應(yīng)用 | 細(xì)胞培養(yǎng)與體內(nèi)應(yīng)用 | 體內(nèi)應(yīng)用 | 體內(nèi)應(yīng)用 | 細(xì)胞培養(yǎng)與體內(nèi)應(yīng)用 |
| 體內(nèi)免疫反應(yīng) | 低 | 低 | 高 | 非常低 | 高 |
VACV載體自身不能直接用于生產(chǎn)活病毒，除非與野生型的痘病毒共轉(zhuǎn)包裝細(xì)胞。云舟生物優(yōu)化了VACV的包裝工藝，在足夠的安全性條件下可以包裝出很高滴度的VACV。
VACV可以在生物安全2級(jí)（BSL-2）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作。但是由于生物安全政策在不同的機(jī)構(gòu)中可能有所差異，我們建議研究者需要根據(jù)自身所處機(jī)構(gòu)的生物安全指引來操作所有病毒載體。
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