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載體設(shè)計與克隆
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進(jìn)一步了解 >> 我們的質(zhì)量體系通過ISO 9001認(rèn)證。這些產(chǎn)品是在我們先進(jìn)的設(shè)施中嚴(yán)格控制下生成的。

基因敲入細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株

云舟生物的基因敲入穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株可實現(xiàn)對細(xì)胞基因組靶位點的永久敲入。我們的基因敲入細(xì)胞采用CRISPR相關(guān)技術(shù)制備，需要針對轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的靶位點導(dǎo)入一個特異性的gRNA/Cas9 RNP復(fù)合物，以及一個可通過HDR修復(fù)方式引入供體序列的供體載體。我們擁有一系列獨特的技術(shù)，可讓我們在很短的周期內(nèi)實現(xiàn)具有高HDR率的高效基因遞送，高成功率獲得敲入純合子。

亮點：

  • 超高整合效率：使用我們設(shè)計的供體載體和基因遞送方式，大部分靶細(xì)胞的HDR率可達(dá)到30-50%。
  • 大片段敲入：可向多種類型細(xì)胞插入長達(dá)1 kb的DNA片段，包括ESC和iPSC。
  • 周期短：載體設(shè)計完成后的單克隆敲入細(xì)胞從改造到交付，快至16周。
服務(wù)詳情
Workflow for gene overexpression stable cell line engineering

圖1 基因敲入穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建流程。

訂購信息
服務(wù)交付內(nèi)容價格(CNY)周期
基因敲入細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建（插入片段<3 kb）一個單克隆細(xì)胞株（>106個細(xì)胞/管, 2管）￥40,980起 14-20周
兩個單克隆細(xì)胞株（>106個細(xì)胞/管, 每個克隆各2管）請咨詢
基因敲入細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建（插入片段>3 kb）一個單克隆細(xì)胞株（>106個細(xì)胞/管, 2管）￥67,980起16-24周
兩個單克隆細(xì)胞株（>106個細(xì)胞/管, 每個克隆各2管）請咨詢

* 增加交付單克隆數(shù)將收取額外費用。

QC試驗
試驗項目方法
基因敲入驗證（默認(rèn)）

基因型PCR、Sanger測序

表達(dá)測試（額外收費）RT-qPCR、WB、IF、FACS
脫靶效應(yīng)分析（額外收費）NGS、PCR、Sanger測序
染色體分析（額外收費）核型分析
無菌測試（默認(rèn)）PCR檢測支原體、生物負(fù)荷檢測等
下游服務(wù)
對于您的細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株，我們可以開展多種類型的表型分析和功能驗證，保括細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、細(xì)胞活力、細(xì)胞毒性等。
案例分析
Validation of CRISPR knockin iPSC cell line

圖2 CRISPR介導(dǎo)的iPSC基因敲入。通過電轉(zhuǎn)法向iPSC中導(dǎo)入Cas9/gRNA RNP復(fù)合物和供體載體，成功敲入UBC驅(qū)動表達(dá)的EGFP（2432 bp）。（A）Sanger測序確認(rèn)EGFP成功敲入靶位點。（B）基因型PCR分析四個敲入純合子的單克隆。野生型（WT）靶點的長度為762 bp，敲入了EGFP的靶點的長度為3194 bp。（C）顯微鏡下的成功敲入的細(xì)胞具有EGFP熒光。（D）核型分析結(jié)果。（E）EGFP敲入的iPSC中多能性標(biāo)記物（NANOG、OCT4和SOX2）的免疫熒光結(jié)果。

常見問題解答

基因敲除依賴于非同源末端連接 (NHEJ) 介導(dǎo)的 CRISPR 引起的DNA雙鏈斷裂 (DSB) 修復(fù)，該機(jī)制容易出錯，移碼或片段刪除（使用雙 gRNA 時）等突變會以一定頻率發(fā)生，導(dǎo)致目標(biāo)基因功能喪失。另一方面，基因敲入則依賴于同源定向修復(fù)（HDR）機(jī)制，可將供體片段精確插入靶位點，其效率比NHEJ低，且僅限用于分裂細(xì)胞。此外，HDR效率也因細(xì)胞類型而異。因此，基因敲入在技術(shù)上比基因敲除更具挑戰(zhàn)性。

選擇供體模板的首要考慮因素是您的模板大小。對于小片段插入（<10 kb）,ssODN通常是最佳的選擇，其HDR效率較高。對于大片段，可因情況選擇使用線性dsDNA（細(xì)胞毒性較高，HDR率高）或者環(huán)狀質(zhì)粒載體（細(xì)胞耐受性好，HDR率低）。

藥篩后獲得陽性轉(zhuǎn)導(dǎo)的混合細(xì)胞群。采用血細(xì)胞計數(shù)板等工具確定細(xì)胞數(shù)量和濃度。對細(xì)胞進(jìn)行梯度稀釋，然后在96孔板中培養(yǎng)，并使其濃度為<1 細(xì)胞/孔。單獨的細(xì)胞克隆將被分離并擴(kuò)增，對其進(jìn)行基因型鑒定。

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載體構(gòu)建 
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