云舟生物可以為您的目的基因構建敲低效果長效的細胞穩(wěn)轉株。為保證敲低效率，每個細胞株獨自接受來自3個shRNA慢病毒中的一個的病毒轉導。經過RT-qPCR驗證，我們交付敲低效率最佳的細胞株。此外，每批細胞產品放行前，我們還會開展一系列QC試驗，比如無菌測試、支原體檢測等。
亮點：
圖1 基因敲低穩(wěn)轉細胞株的構建流程。
| 服務 | 交付內容 | 價格(CNY) | 周期 |
|---|---|---|---|
| 基因敲低細胞穩(wěn)轉株構建 | 多克隆細胞群（>106個細胞/管，2管） | ￥18,980起 | 8-11周 |
| 兩個單克隆細胞株（>106個細胞/管，每個克隆各2管） | ￥21,980起 | 13-16周 |
* 增加交付單克隆數將收取額外費用。
| 試驗項目 | 方法 |
| 基因敲低驗證（默認） | RT-qPCR |
| 表達測試（額外收費） | RT-qPCR、WB、IF、FACS |
| 無菌測試（默認） | PCR檢測支原體、生物負荷檢測等 |
圖2 在Hep-G2細胞中高效敲低DNAJC12基因。（A）攜帶EGFP的DNAJC12 shRNA慢病毒轉導Hep-G2。（B）RT-qPCR檢測基因敲低效率達90.9%。三次重復試驗；p value<0.001。
我們設計和評估shRNA的規(guī)則與RNAi consortium（TRC）使用的規(guī)則類似。對于每個RefSeq轉錄本，我們會搜索出所有的21 mers作為候選靶位點。以下因素會降低干擾效率/特異性或影響克隆，含有這些特點的序列將會被排除。主要因素包括：含有≥4個連續(xù)相同堿基，含有≥7個G或C，GC含量<25％或> 60％以及序列的5'端含有AA堿基。如果靶點內部含有莖環(huán)結構，或是3'末端的GC含量較高，或是該靶點是已知的miRNA核心序列或是會打靶到其他基因，則該靶點的分值就會較低。若靶位點存在于一個基因的多個轉錄本，則該靶點的分值就會較高。 所有的干擾分值均≥0，平均數約為5，標準差約為5，95%的分值均≤15。若一個shRNA的干擾分值是15，則表示具有很高干擾效率且易于克隆；若干擾分值為0，則表示干擾效果較差或難以克隆。
為了確定哪種方法最適合您的實驗應用，以下是您應該考慮的一些事項。
基本原理
基因敲低載體表達shRNA抑制靶基因的mRNA，通過引發(fā)mRNA的切割抑制翻譯過程。shRNA敲低不改變靶基因的DNA序列。
CRISPR和TALEN都是通過指導核酸酶切割基因組中的特定靶位點來發(fā)揮作用。然后這些切割位點被細胞低效地修復，從而導致修復部位的永久性突變，比如產生基因的小片段插入或堿基缺失。這類突變的一部分會導致基因的閱讀框移碼、出現提前終止密碼子等，最終導致目的基因的功能喪失。如果同時靶向基因組中兩個相鄰緊密的切割位點（距離幾個kb），也可以導致其間區(qū)域的刪除。
效率
shRNA敲低永遠不會完全抑制靶基因的表達。即使對于最有效的shRNA，靶基因的一些殘留表達也會保留。相比之下，在一小部分經過處理的細胞群中，CRISPR和TALEN可以產生永久性突變，這可能導致基因功能完全喪失。
一致性和均一性
shRNA載體通常在轉染/轉導的細胞時獲得較好的均一性，實驗之間的一致性也較佳。相比之下，由于引入突變是隨機的，CRISPR和TALEN的基因編輯效果在細胞之間的差異相當大。為了完全敲除細胞中的目的基因，必須敲除細胞中基因的所有拷貝。鑒于正常細胞具有任何基因的兩個拷貝（X或Y連鎖基因除外），而癌細胞可以具有兩個以上的拷貝，這種完全敲除的細胞可能只占所有處理后的細胞的一小部分。出于這個原因，核酸酶介導的敲除實驗需要通過測序來篩選克隆，以確定所有目的基因拷貝都被敲除的子細胞群。
脫靶效應
已有報道表明shRNA介導的基因敲低和核酸酶介導的基因敲除均會產生脫靶效應。脫靶效應的表征可以通過使用多個不同的shRNA 靶向同一基因來評估。如果一個基因被在多個不同的shRNA作用下仍然表現出一致的表征，則這種表征通常則不是脫靶效應帶來的。對于CRISPR或TALEN基因敲除，應分析含有功能喪失突變的多個克隆，以包含可能由脫靶突變引起的任何表征。此外，可以對克隆進行脫靶位點測序，通過生物信息學方法鑒定以查看它們是否已發(fā)生突變。
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